Nature?|?靶向microRNA降解的E3泛素連接酶新機(jī)制

撰文 |咸姐

MicroRNA（miRNA）作為一類重要的基因表達(dá)調(diào)控分子，通常與Argonaute（AGO）蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，通過識別靶標(biāo)RNA的互補(bǔ)序列來抑制基因表達(dá)。盡管miRNA的調(diào)控功能已被廣泛研究，但其自身的穩(wěn)定性如何被調(diào)控，尤其是如何被選擇性降解，一直是領(lǐng)域內(nèi)未解的關(guān)鍵問題。近年來，一種被稱為“靶標(biāo)介導(dǎo)的miRNA降解”（TDMD）的非經(jīng)典途徑逐漸受到關(guān)注。與經(jīng)典的miRNA抑制靶標(biāo)RNA的邏輯相反，TDMD過程中存在一類特殊的“觸發(fā)”RNA，它們通過與miRNA形成更為廣泛的堿基配對——不僅限于種子區(qū)，還延伸至miRNA的3′區(qū)域——誘導(dǎo)AGO-miRNA復(fù)合物發(fā)生構(gòu)象變化，進(jìn)而觸發(fā)AGO蛋白的降解，最終導(dǎo)致釋放出的miRNA被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶清除。這一過程在病毒感染、發(fā)育調(diào)控和疾病發(fā)生中具有重要生物學(xué)意義。遺傳學(xué)研究表明，TDMD依賴于一個(gè)非典型的Cullin-RING E3泛素連接酶（CRL），其中ZSWIM8蛋白作為底物識別受體，與CUL3、ELOB、ELOC等核心組分共同組裝，并協(xié)同RBR型E3連接酶ARIH1，介導(dǎo)AGO蛋白的泛素化修飾【1,2】。然而，TDMD的分子機(jī)制仍存在諸多根本性問題：ZSWIM8如何在數(shù)百萬個(gè)僅與種子區(qū)配對的普通靶標(biāo)位點(diǎn)中，精準(zhǔn)識別出數(shù)量稀少且與觸發(fā)RNA形成廣泛配對的AGO-miRNA復(fù)合物？這種選擇性識別的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是什么？ZSWIM8與CUL3的組裝方式是否代表了E3連接酶家族中一個(gè)全新的亞類？更為重要的是，觸發(fā)RNA如何在分子層面“指示”AGO蛋白成為泛素化底物，從而突破傳統(tǒng)“降解子”（degron）概念的局限？

圍繞著上述核心科學(xué)問題，近日，來自德國馬克斯·普朗克生物化學(xué)研究所的Brenda A. Schulman團(tuán)隊(duì)在Nature上在線發(fā)表題為The E3 ubiquitin ligase mechanism specifying targeted microRNA degradation的文章，通過整合生物化學(xué)重構(gòu)、細(xì)胞功能驗(yàn)證和高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析，首次揭示了ZSWIM8-CUL3 E3連接酶如何通過識別由miRNA與觸發(fā)RNA協(xié)同誘導(dǎo)的AGO構(gòu)象變化，實(shí)現(xiàn)“雙RNA因子認(rèn)證”的底物特異性識別機(jī)制。這一發(fā)現(xiàn)不僅為理解TDMD的分子基礎(chǔ)提供了直接證據(jù)，也拓展了我們對泛素化底物識別機(jī)制的認(rèn)知，展示了RNA-RNA相互作用如何通過變構(gòu)調(diào)控蛋白質(zhì)修飾，從而在復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄組背景下實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的分子識別與降解控制。

盡管有遺傳學(xué)和分子學(xué)證據(jù)支持TDMD的E3模型，但尚未有能進(jìn)行TDMD的AGO發(fā)生泛素化作用的相關(guān)報(bào)道。本文研究人員通過體外重建實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)，AGO2只有在結(jié)合觸發(fā)RNA后，才會(huì)被ZSWIM8–CUL3–ARIH1復(fù)合物特異性催化發(fā)生多聚泛素化；而使用無法與miRNA 3′區(qū)域配對的“僅配對種子區(qū)（seed-only）”突變型觸發(fā)RNA則不能誘導(dǎo)該修飾。此外，該過程對E3連接酶組分具有嚴(yán)格選擇性，只有當(dāng)ZSWIM8與CUL3配對并協(xié)同ARIH1時(shí)才能實(shí)現(xiàn)，替換為其他cullin（如CUL2或CUL5）及其相應(yīng)的RBR E3（如ARIH2）則無效。由此可見，AGO2在結(jié)合miRNA后，本身并非ZSWIM8–CUL3的底物，只有當(dāng)其進(jìn)一步結(jié)合觸發(fā)RNA時(shí)，才會(huì)被特異性識別并發(fā)生多聚泛素化，從而確立了觸發(fā)RNA在指導(dǎo)AGO泛素化中的關(guān)鍵作用。

隨后，研究人員通過體外免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ZSWIM8優(yōu)先與包含觸發(fā)RNA的AGO2–miR-7三元復(fù)合物結(jié)合，其富集程度比“seed-only”的對照高出70倍以上，而僅提供3′端補(bǔ)充配對的靶RNA（這種配對雖能增強(qiáng)親和力但不足以觸發(fā)TDMD）同樣無法促進(jìn)ZSWIM8結(jié)合。由此顯示了ZSWIM8對AGO–miRNA–觸發(fā)三元復(fù)合物的優(yōu)先結(jié)合，且該選擇性結(jié)合在不同AGO同源蛋白和不同miRNA–觸發(fā)對中具有普適性，且嚴(yán)格依賴同源的miRNA–觸發(fā)配對，表明ZSWIM8對觸發(fā)RNA誘導(dǎo)的復(fù)合物構(gòu)象的優(yōu)先識別，是其實(shí)現(xiàn)底物選擇性的核心機(jī)制。值得一提的是，研究人員發(fā)現(xiàn)觸發(fā)RNA上位于miRNA結(jié)合位點(diǎn)兩側(cè)的側(cè)翼序列對ZSWIM8識別至關(guān)重要。添加額外的CYRANO側(cè)翼序列可使ZSWIM8與AGO2–miR-7–觸發(fā)復(fù)合物的結(jié)合效率提升100倍，且選擇性仍保持超過100倍的偏好性。側(cè)翼序列經(jīng)隨機(jī)打亂后促進(jìn)作用仍不變。事實(shí)上，濾膜結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)ZSWIM8對RNA具有序列非依賴性的弱親和力，且隨RNA長度增加而增強(qiáng)，這表明側(cè)翼序列通過提供額外的RNA–蛋白質(zhì)相互作用界面，顯著增強(qiáng)了ZSWIM8對底物復(fù)合物的識別效率。

為了深入了解TDMD底物識別的結(jié)構(gòu)機(jī)制，研究人員通過冷凍電鏡解析了ZSWIM8–CUL3與AGO2–miR-7–CYRANO復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)（分辨率3.1 ?）。結(jié)構(gòu)顯示，ZSWIM8形成二聚體，每個(gè)原體伸出α螺旋束，兩個(gè)原體以不對稱的方式夾緊一個(gè)AGO2–miR-7–CYRANO復(fù)合物：其中一個(gè)原體（稱為ZSWIM8 NPAZ ）與AGO2的N結(jié)構(gòu)域和PAZ結(jié)構(gòu)域相互作用，而另一個(gè)原體（稱為ZSWIM8 MID ）則與AGO2的MID結(jié)構(gòu)域相互作用。該結(jié)構(gòu)揭示了觸發(fā)RNA通過重塑AGO2和miRNA–觸發(fā)雙鏈的構(gòu)象，使PAZ結(jié)構(gòu)域中原本結(jié)合miRNA 3′端的口袋空出并與ZSWIM8結(jié)合，同時(shí)觸發(fā)RNA側(cè)翼區(qū)域環(huán)繞ZSWIM8夾鉗并與其帶正電表面相互作用，共同構(gòu)成了決定選擇性的多價(jià)結(jié)合界面。與此同時(shí)，通過結(jié)構(gòu)分析和功能驗(yàn)證，研究人員發(fā)現(xiàn)ZSWIM8–CUL3代表了一類獨(dú)特的cullin–RING E3連接酶。ZSWIM8與其他已知的CRL底物受體在結(jié)構(gòu)上存在根本差異，其核心在于一個(gè)由SWIM結(jié)構(gòu)域、D結(jié)構(gòu)域、SWIM belt以及獨(dú)特的BC-cullin-box共同組成的二聚化E3超結(jié)構(gòu)域。其中SWIM結(jié)構(gòu)域是中心組織者，D結(jié)構(gòu)域通過相互纏繞使二聚化不可逆。尤為關(guān)鍵的是，ZSWIM8具有ZSWIM家族特異的CUL3-box，可特異性地與CUL3結(jié)合而排除其他cullin，而CUL3獨(dú)特的N端尾部則錨定于ZSWIM8的相應(yīng)溝槽中。破壞該相互作用會(huì)削弱CUL3結(jié)合并消除AGO2泛素化及TDMD功能，這些特征在其他ZSWIM家族成員中保守，共同定義了這一獨(dú)特的E3連接酶類別。

那么，觸發(fā)RNA如何通過重塑AGO–miRNA復(fù)合物構(gòu)象，使ZSWIM8能夠以多價(jià)相互作用實(shí)現(xiàn)特異性識別的呢？結(jié)構(gòu)比較顯示，觸發(fā)RNA誘導(dǎo)的TDMD特異性構(gòu)象使AGO2 PAZ結(jié)構(gòu)域中原本結(jié)合miRNA 3′端的口袋處于空缺狀態(tài)，同時(shí)PAZ結(jié)構(gòu)域發(fā)生移位。ZSWIM8二聚體以不對稱方式夾緊AGO2：ZSWIM8 NPAZ 原體的TDMD感應(yīng)器通過其TDMD感應(yīng)元件（第311–325位殘基）插入PAZ結(jié)構(gòu)域的空腔并與發(fā)夾形成β折疊，同時(shí)與AGO2的N結(jié)構(gòu)域相互作用；ZSWIM8 MID 原體則通過HEAT重復(fù)3–6的凹面識別MID結(jié)構(gòu)域，其中苯丙氨酸F1261插入MID結(jié)構(gòu)域的疏水空腔中形成錨定。功能實(shí)驗(yàn)則進(jìn)一步驗(yàn)證了這些相互作用的重要性，突變TDMD感應(yīng)元件、F1261或AGO2中相應(yīng)的互作殘基均嚴(yán)重削弱ZSWIM8挽救TDMD的能力和AGO2多聚泛素化活性。使用3′端截短的miRNA強(qiáng)制PAZ口袋空缺后，觸發(fā)RNA與“seed-only”對照之間的結(jié)合差異顯著縮小，但觸發(fā)RNA仍能誘導(dǎo)一定程度的識別，表明PAZ口袋空缺是重要但非唯一的識別特征。此外，細(xì)胞內(nèi)短于19核苷酸的miRNA確實(shí)更易被ZSWIM8降解，提示該機(jī)制具有更廣泛的生理意義。這些結(jié)果表明，觸發(fā)RNA通過重塑AGO構(gòu)象、空出PAZ口袋并引導(dǎo)多價(jià)相互作用，共同構(gòu)成了ZSWIM8特異性識別TDMD底物的分子基礎(chǔ)。

與此同時(shí)，研究人員還發(fā)現(xiàn)，miRNA–觸發(fā)雙鏈內(nèi)部環(huán)結(jié)構(gòu)在種子螺旋與遠(yuǎn)端螺旋之間形成一個(gè)彎折，導(dǎo)致遠(yuǎn)端螺旋的走向與其他AGO2–miRNA–靶標(biāo)構(gòu)象不同，從而促進(jìn)該螺旋末端與ZSWIM8 NPAZ 的接觸。高分辨率結(jié)構(gòu)顯示，ZSWIM8 NPAZ 的TDMD感應(yīng)器內(nèi)有一個(gè)稱為RBE1（第395–408位殘基）的環(huán)區(qū)，楔入TDMD感應(yīng)元件、miRNA–觸發(fā)雙鏈和HEAT重復(fù)亞結(jié)構(gòu)域之間，與AGO2 PAZ結(jié)構(gòu)域共同夾緊miR-7的末端幾圈，RBE1突變可削弱ZSWIM8功能。低分辨率密度圖則顯示觸發(fā)RNA的5′和3′側(cè)翼區(qū)域分別環(huán)繞ZSWIM8 NPAZ 和ZSWIM8 MID 的帶正電環(huán)區(qū)RBE2和RBE3，三個(gè)環(huán)區(qū)的同時(shí)突變會(huì)導(dǎo)致TDMD功能嚴(yán)重喪失。此外，刪除側(cè)翼序列會(huì)降低ZSWIM8結(jié)合與AGO2泛素化，其中5′側(cè)翼影響更大，且該效應(yīng)依賴miRNA 3′配對所決定的RNA走向。改變內(nèi)部環(huán)長度或使用完全互補(bǔ)配對的靶RNA（二者均改變RNA雙鏈的走向）也削弱ZSWIM8識別。這些結(jié)果表明，觸發(fā)RNA通過其獨(dú)特的雙鏈走向引導(dǎo)側(cè)翼序列與ZSWIM8兩個(gè)原體的多個(gè)RNA結(jié)合元件相互作用，共同穩(wěn)定E3連接酶對底物的夾持。

綜上所述，本研究通過生化重構(gòu)、細(xì)胞功能驗(yàn)證與冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析，首次揭示了ZSWIM8–CUL3 E3連接酶特異性識別觸發(fā)RNA結(jié)合的AGO–miRNA復(fù)合物的分子機(jī)制。ZSWIM8形成不對稱二聚體，通過多價(jià)相互作用 識別觸發(fā)RNA誘導(dǎo)的AGO構(gòu)象變化，包括PAZ口袋空出、雙鏈走向改變及側(cè)翼序列環(huán)繞結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了“雙RNA因子認(rèn)證”的底物特異性識別（圖1）。這一發(fā)現(xiàn)突破傳統(tǒng)降解子概念，為理解TDMD的精準(zhǔn)調(diào)控及泛素化底物識別機(jī)制提供了全新范式。

圖1

https://doi.org/10.1038/s41586-026-10232-0

制版人： 十一

參考文獻(xiàn)

1. Hiers, N. M., Li, T., Traugot, C. M. & Xie, M. Target-directed microRNA degradation: mechanisms, significance, and functional implications.Wiley Interdiscip. Rev. RNA15, e1832 (2024).

2. Shi, C. Y. et al. The ZSWIM8 ubiquitin ligase mediates target-directed microRNA degradation.Science370, eabc9359 (2020).

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