Nature：康熙帝的“救命藥”，合成之謎終獲解

關(guān)于金雞納霜（奎寧，又名金雞納堿）這種初代抗瘧疾神藥，網(wǎng)上有幾則流傳甚廣的小故事。清康熙三十二年（1693年）五月，康熙帝患上了瘧疾，高燒不退，御醫(yī)束手無(wú)策，后來(lái)在京的法國(guó)傳教士進(jìn)獻(xiàn)了金雞納霜，療效甚佳，皇帝性命得以保全。此后，康熙五十一年（1712年）七月，曹寅（曹雪芹祖父）染上瘧疾，他向康熙帝討要以曹家之富也無(wú)法搞到的金雞納霜，康熙帝不但立刻應(yīng)允，還“恐遲延，所以賜驛馬星夜趕去”，他叮囑曹寅“若不是瘧疾，此藥用不得，須要認(rèn)真。”可惜曹寅實(shí)在運(yùn)氣不佳，沒(méi)有等到神藥，就不治而亡。

金雞納樹(shù)的花與干樹(shù)皮。圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)

不論故事的真實(shí)性有幾何，以奎寧（quinine，1a）為代表的金雞納生物堿確確實(shí)實(shí)是一類(lèi)具有重要臨床應(yīng)用價(jià)值的天然產(chǎn)物，人類(lèi)使用長(zhǎng)達(dá)數(shù)百年，對(duì)這類(lèi)天然產(chǎn)物的研究也超過(guò)兩百五十年。奎寧之外，奎尼丁（quinidine，2a）是重要的抗心律失常藥物，而辛可尼丁1（cinchonidine）和辛可寧2（cinchonine）則廣泛用作不對(duì)稱(chēng)合成中的手性催化劑。有趣的是，這些生物堿的二氫類(lèi)似物（如：氫化辛可寧丁（1′）、氫化辛可寧（2′）、氫化奎寧（1a′）、氫化奎尼丁（2a′））也可通過(guò)植物分離，并顯示出與奎寧、奎尼丁相仿的性質(zhì)。盡管這些化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)早已明確，但其在植物中的生物合成途徑卻長(zhǎng)期未被揭示。從生物合成的角度來(lái)看，金雞納生物堿屬于單萜吲哚生物堿，理論上由色胺3（tryptamine）和裂環(huán)馬錢(qián)子苷4（secologanin）經(jīng)異胡豆苷合酶（STR）催化生成異胡豆苷5（strictosidine），再經(jīng)酶解脫糖后在還原酶和酯酶的作用下形成dihydrocorynantheal（6'）。植物喂養(yǎng)研究表明6'和corynantheal（6）同系物都經(jīng)過(guò)一系列未知步驟平行轉(zhuǎn)化并形成假設(shè)的吲哚-奎寧環(huán)中間體辛可胺（7）和二氫辛可胺（7'），這些中間體再通過(guò)一系列未知的化學(xué)轉(zhuǎn)化形成1、1'、2和2'的喹啉核心骨架。另外，喂養(yǎng)研究已證實(shí)甲氧基化同系物的生物合成是通過(guò)與1和2相同的方式進(jìn)行，即使用5-甲氧基色胺（3a'）代替3作為吲哚起始前體（圖1）。雖然獲得了一些進(jìn)展，但corynantheal骨架如何轉(zhuǎn)化為這些生物堿的機(jī)制仍是未解之謎。

近日，德國(guó)馬克斯-普朗克化學(xué)生態(tài)學(xué)研究所的Sarah E. O’Connor教授和美國(guó)佐治亞大學(xué)的C. Robin Buell教授課題組系統(tǒng)地揭示了從corynantheal到最終金雞納生物堿（包括其二氫和甲氧基化衍生物）的完整生物合成途徑，鑒定了所有關(guān)鍵中間體，克隆了所有負(fù)責(zé)這些轉(zhuǎn)化的酶基因，并進(jìn)行了功能表征。該研究并未依賴(lài)單一技術(shù)，而是創(chuàng)造性地整合了經(jīng)典與前沿的研究方法，形成了一套強(qiáng)大的“組合拳”，具體而言：1）同位素標(biāo)記與喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了“on-pathway”中間體；2）病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）在植物體內(nèi)驗(yàn)證候選基因的功能；3）單細(xì)胞核RNA測(cè)序獲得高分辨率的細(xì)胞類(lèi)型特異性基因表達(dá)譜，精確定位生物合成基因活躍的細(xì)胞區(qū)域，并用于候選基因篩選；4）比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)，跨物種（金雞納、大葉蛇根草、帽蕊木）比較，識(shí)別保守的生物合成基因；5）蛋白質(zhì)組學(xué)與酶活性分級(jí)分離，從植物粗提物中尋找催化活性并通過(guò)質(zhì)譜鑒定相關(guān)蛋白；6）異源表達(dá)與酶學(xué)表征，在本氏煙草中瞬時(shí)表達(dá)候選基因，或在大腸桿菌/酵母中純化蛋白進(jìn)行體外功能驗(yàn)證。相關(guān)成果發(fā)表在Nature上。

圖1. 金雞納生物堿的可能生物合成途徑。圖片來(lái)源：Nature

早期的實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)將6加入金雞納的細(xì)胞培養(yǎng)物中時(shí)會(huì)迅速被還原為相應(yīng)的corynantheol（11）。為此，作者化學(xué)合成了同位素標(biāo)記的類(lèi)似物d5-corynantheol（11b）并將其飼喂于金雞納植物組織，液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）成功檢測(cè)到下游產(chǎn)物d5-cinchonidine（1b）、d5-cinchonine（2b）和d5-cinchonamine（10b），進(jìn)而證實(shí)11是一種“on-pathway”中間體（圖2a-c）。其次，作者還檢測(cè)到11b的同位素有效摻入到一種未知代謝產(chǎn)物中（圖2d），通過(guò)飼養(yǎng)、LC-MS分析、大規(guī)模分離、半合成以及NMR分析證實(shí)其為一種全新的季銨化合物并將其命名為chinonium（12，圖2e）。進(jìn)一步飼喂實(shí)驗(yàn)表明12可轉(zhuǎn)化為cinchonaminal（7），后者在植物中主要以環(huán)化形式cyclocinchonaminal（13）存在（圖2f、2g）。總之，這三個(gè)中間體（11、12、13）的發(fā)現(xiàn)為重新構(gòu)建金雞納生物堿的合成途徑提供了關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

圖2. 通過(guò)飼喂實(shí)驗(yàn)鑒定三種關(guān)鍵的中間體（11–13）。圖片來(lái)源：Nature

隨后，作者通過(guò)共表達(dá)分析篩選出30個(gè)候選轉(zhuǎn)移酶并在本氏煙草中瞬時(shí)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)BAHD家族酰基轉(zhuǎn)移酶可將11轉(zhuǎn)化為malonyl-corynantheol（14）。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)該酶使用malonyl-CoA作為酰基供體，并將其命名為O-malonyltransferase（MAT）。此外，作者還通過(guò)病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）來(lái)評(píng)估MAT在體內(nèi)的功能，結(jié)果顯示在沉默MAT后，corynantheol及其衍生物在金雞納樹(shù)葉中大量積累，這證明MAT在體內(nèi)確實(shí)參與該反應(yīng)（圖3a）。其次，作者通過(guò)整合單核RNA測(cè)序、蛋白質(zhì)組學(xué)分析和比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)篩選出20個(gè)候選基因（圖3c-3f），最終發(fā)現(xiàn)另一個(gè)BAHD酰基轉(zhuǎn)移酶家族（即malonyl-corynantheol cyclase（MCC））能夠催化malonyl-corynantheol的環(huán)化反應(yīng)并生成12（圖3g、3h），而且該反應(yīng)不依賴(lài)輔因子，具有嚴(yán)格的底物特異性，僅識(shí)別malonylated底物。值得注意的是，盡管MAT和MCC同屬BAHD酰基轉(zhuǎn)移酶家族，但是序列相似性?xún)H19.5%，并且MCC已喪失酰基轉(zhuǎn)移酶活性，進(jìn)化出新的環(huán)化功能，這一發(fā)現(xiàn)拓寬了BAHD酰基轉(zhuǎn)移酶家族的功能譜。緊接著，作者鑒定出一種2-酮戊二酸依賴(lài)性雙加氧酶并將其命名為Cinchonaminal synthase（CiS），其能將12轉(zhuǎn)化為cinchonaminal（7）。CiS在本氏煙草中表達(dá)后可催化12生成13，但同時(shí)也生成過(guò)氧化產(chǎn)物cinchonaminal acid（15），這表明其活性需被下游酶迅速“捕獲”。CiS產(chǎn)物被進(jìn)一步還原得到cinchonamine（10），該反應(yīng)由一種醇脫氫酶Cinchonaminal reductase（CiR）催化。需要指出的是，CiR與CiS在單核RNA測(cè)序中呈現(xiàn)共表達(dá)模式且在細(xì)胞類(lèi)型上均富集于表皮細(xì)胞。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)一個(gè)CYP71家族的細(xì)胞色素P450酶cinchonaminal oxidase（CiO）能夠催化cinchonaminal的吲哚氧化開(kāi)環(huán)并重排為喹啉結(jié)構(gòu)，從而生成cinchonidinone（8）和cinchoninone（9），這是整個(gè)途徑中形成喹啉環(huán)的關(guān)鍵步驟。VIGS沉默CiO后，13和10顯著積累，而8和9顯著減少，證實(shí)了其在體內(nèi)的功能。金雞納生物堿生物合成的最后一步涉及將8/9還原為最終產(chǎn)物1/2，作者鑒定出一種aldo-keto還原酶Keto-reductase（KR4），后者KR4在體外表現(xiàn)出良好的還原活性，但在本氏煙草中未能檢測(cè)到活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)本氏煙草提取物中含有抑制KR4活性的因子，從而解釋了異源系統(tǒng)中還原步驟缺失的原因。

圖3. MCC 的發(fā)現(xiàn)與功能鑒定。圖片來(lái)源：Nature

有了這些被鑒定和功能表征的酶，金雞納生物堿生物合成途徑可以在異源宿主本氏煙中重構(gòu)。具體來(lái)說(shuō)，將廣為人知的中心單萜吲哚生物堿前體5作為底物外源供給本氏煙葉片，這些葉片已經(jīng)用DCS、DCE、MAT、MCC、CiS和CiO以及一個(gè)編碼來(lái)自系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)植物長(zhǎng)春花的異胡豆苷β-葡萄糖苷酶（CrSGD）的構(gòu)建體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。正如預(yù)期的那樣，異胡豆苷被有效地轉(zhuǎn)化為8'和9'。改用甲氧基化類(lèi)似物10-OMe異胡豆苷（5a）則導(dǎo)致形成8a'和9a'，這一結(jié)果證實(shí)了下游酶的底物靈活性，并為先前提出的甲氧基化生物堿的平行生物合成途徑提供了明確的實(shí)驗(yàn)支持。值得注意的是，將STR、T5H、OMT1和液泡異胡豆苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白STTr加入基因堆疊，并用3和4替換5，導(dǎo)致了甲氧基化和非甲氧基化酮式喹啉的混合物形成，進(jìn)而模擬了這些二氫生物堿在金雞納樹(shù)中的存在情況（圖4a）。由于在這些測(cè)定條件下，DCS導(dǎo)致形成6'，因此作者測(cè)試了合成11作為外源底物用于本氏煙葉盤(pán)以觀察8和9的形成（圖4b）。此外，在本研究開(kāi)始時(shí)鑒定的中間體11、12和13，在對(duì)這些轉(zhuǎn)化的本氏煙葉片進(jìn)行分析時(shí)被檢測(cè)到。相比之下，當(dāng)MAT下游的酶（MCC、CiS和CiO）存在時(shí)，14是檢測(cè)不到的，這一結(jié)果與天然金雞納樹(shù)代謝物譜中缺乏這種瞬時(shí)中間體相一致。總的來(lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)凸顯了使用這些生物合成基因進(jìn)行藥用相關(guān)喹啉生物堿生物合成的潛力。

圖4. 喹啉金雞納生物堿的生物合成。圖片來(lái)源：Nature

定向生物合成是一種已使用數(shù)十年的方法，用于生產(chǎn)工業(yè)上重要的天然產(chǎn)物類(lèi)似物，該方法向生成產(chǎn)物的宿主提供外源非天然起始底物。然而，為了成功生產(chǎn)最終產(chǎn)物類(lèi)似物，這種方法要求所有下游酶都能催化所有相應(yīng)非天然生物合成中間體的轉(zhuǎn)化。由于金雞納生物合成酶天然地作用于甲氧基和二氫衍生物，因此作者推斷這些生物合成酶將非常適合用于生產(chǎn)非天然生物堿類(lèi)似物。事實(shí)上，將轉(zhuǎn)化了STR、CrSGD、DCS、DCE、MAT、MCC、CiS和CiO的本氏煙葉片滲入一系列3的類(lèi)似物（如：5-氟色胺、5-氯色胺、6-氟色胺、6-氯色胺、7-氟色胺和7-氯色胺）以及天然輔底物4，發(fā)現(xiàn)在所有情況下都觀察到鹵代色胺底物被消耗，同時(shí)存在質(zhì)量數(shù)和MS/MS模式與形成相應(yīng)二氫辛可寧酮和二氫辛可尼酮類(lèi)似物一致的化合物（圖5），這些結(jié)果表明鑒定的生物合成基因可用于生產(chǎn)鹵代的金雞納生物堿類(lèi)似物，考慮到鹵代喹啉的臨床用途和吸引力，這些類(lèi)似物可能對(duì)藥物化學(xué)應(yīng)用有重要價(jià)值。

圖5. 喹啉金雞納生物堿鹵代類(lèi)似物的生物合成。圖片來(lái)源：Nature

總結(jié)

本文報(bào)道了負(fù)責(zé)金雞納生物堿獨(dú)特的喹啉-奎寧環(huán)骨架生物合成的基因，同位素標(biāo)記、基因沉默、單核RNA測(cè)序和比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)的結(jié)合揭示了幾個(gè)意想不到的生物合成轉(zhuǎn)化過(guò)程。作者還描述了一種以前未被報(bào)道的季銨鹽中間體，它通過(guò)一種不尋常的酶促環(huán)化反應(yīng)生成。這些發(fā)現(xiàn)解開(kāi)了數(shù)百年來(lái)關(guān)于金雞納生物堿骨架如何生物合成的謎團(tuán)，并凸顯了通過(guò)代謝工程方法獲取這些化合物的前景，也為金雞納生物堿的綠色可持續(xù)生產(chǎn)和基于合成生物學(xué)的藥物研發(fā)開(kāi)辟了全新的道路。

Biosynthesis of cinchona alkaloids

Blaise Kimbadi Lombe, Tingan Zhou, Gyumin Kang, Joshua C. Wood, John P. Hamilton, Klaus Gase, Yoko Nakamura, Ryan M. Alam, Ron P. Dirks, Lorenzo Caputi, C. Robin Buell, Sarah E. O’Connor

Nature,2026, DOI: 10.1038/s41586-026-10227-x