Advanced science | 安徽醫科大學徐濤教授團隊研究發現肝纖維化的關鍵驅動因子

肝纖維化是慢性肝病向肝硬化、肝癌進展的關鍵病理階段，全球約有3.3%的人群存在晚期肝纖維化。然而，臨床上至今尚無獲批的抗肝纖維化藥物，其背后的分子機制和有效干預靶點一直是該領域亟待突破的核心難題。近年來，靶向肝星狀細胞（HSCs）被認為是治療肝纖維化最有前景的方向之一。但核孔蛋白NUP85在這一過程中究竟扮演什么角色？此前從未被系統研究過。

2026年3月29日，安徽醫科大學徐濤教授團隊聯合中科大第一附屬醫院陳昭琳教授在Advanced science雜志在線發表題為NUP85 Mediates Endoplasmic Reticulum Stress through the USP47/ASK1 Signaling Pathway to Regulate the Progression of Liver Fibrosis的研究論文首次揭示：NUP85是肝纖維化的關鍵驅動因子。此外，研究團隊開發了靶向活化HSCs的CREKA肽修飾脂質體遞送系統，將NUP85小分子抑制劑Mogroside V精準遞送至活化的HSCs，實現了安全、高效的治療效果。

首先，為評估NUP85與肝纖維化進展的相關性，分析了多個GEO數據集（GSE55747、GSE25097、GSE84044、GSE15654）。結果顯示，在CCl?誘導的肝纖維化、肝硬化及晚期纖維化（S2-4）患者中，NUP85表達均顯著上調，且肝癌肝硬化患者高于非肝癌肝硬化患者；NUP85表達與ACTA2、Col1A1、Col3A1等纖維化標志物呈顯著正相關（r=0.581、0.300、0.413）（圖1A-G）。進一步在臨床肝纖維化患者及小鼠模型中進行驗證，H&E、Masson、天狼猩紅染色證實了典型的纖維化病理改變，免疫熒光、免疫組化、Western blotting及RT-qPCR均顯示NUP85表達顯著升高（圖1H-L，圖S1A-G）。在TGF-β1激活的LX-2細胞中，NUP85表達同樣上調（圖S1H-K）。原代細胞分離實驗表明，NUP85主要在活化的HSCs中選擇性上調，而在肝細胞和肝巨噬細胞中變化不顯著，該現象在CCl?及BDL兩種模型中均得到驗證（圖S2）。以上結果為NUP85表達水平與肝纖維化進展之間的顯著相關性提供了充分證據。

接下來，為探究NUP85在肝纖維化中的作用，分別構建了肝特異性（AAV8介導）和HSCs特異性（AAV2-Lrat介導）NUP85敲低小鼠模型。在CCl?及BDL兩種肝纖維化模型中，肝特異性敲低NUP85可顯著降低血清ALT、AST、ALP水平，減少羥脯氨酸含量，減輕Masson及天狼猩紅染色顯示的膠原沉積面積，并下調纖維化標志物α-SMA、Col1A1、Col3A1的mRNA及蛋白表達（圖S3-S5）。HSCs特異性敲低NUP85同樣改善了上述肝損傷及纖維化指標（圖2，圖S4，圖S6）。為進一步驗證NUP85的促纖維化功能，在NUP85敲除小鼠中通過AAV2-Lrat-oeNUP85恢復（過表達）NUP85，結果顯示ALT、AST、ALP及羥脯氨酸含量升高，膠原沉積面積擴大，α-SMA、Col1A1、Col3A1表達上調，纖維化程度顯著加劇（圖S7-S8）。以上結果表明，NUP85在肝纖維化中發揮促纖維化作用，且該作用主要依賴于HSCs中的NUP85。

為探究NUP85在HSCs活化中的作用，首先確定TGF-β1的最佳刺激條件（10 ng/mL處理24小時），此條件下NUP85蛋白表達達峰值（圖S9A-D）。隨后驗證了NUP85-siRNA和過表達質粒的轉染效率，確認其可有效敲低或上調NUP85表達（圖S9E-L）。功能實驗表明，在TGF-β1誘導的LX-2細胞中，敲低NUP85可顯著降低纖維化標志物α-SMA、Col1A1和Col3A1的mRNA及蛋白水平，而過表達NUP85則上調這些標志物（圖3A-L）。在原代小鼠HSC中，NUP85敲低同樣抑制了細胞自發活化，表現為上述標志物表達降低（圖S10）。以上結果表明，敲低NUP85可有效抑制TGF-β1誘導的HSCs活化。

為闡明NUP85調控肝纖維化的分子機制，對正常和NUP85敲低小鼠肝組織進行RNA-seq，GO富集分析顯示內質網應激（ERS）通路顯著受影響（圖4A-B）。體內外驗證表明，在CCl?誘導的小鼠及TGF-β1刺激的LX-2細胞中，敲低NUP85可顯著降低ERS標志物（GRP78、ATF4、p-IRE1、CHOP）的表達，而過表達NUP85則升高這些標志物水平（圖4C-F，圖S11A-G）。為進一步驗證ERS在NUP85調控肝纖維化中的關鍵作用，使用ERS激活劑衣霉素（TM）進行回補實驗。結果顯示，TM處理可部分逆轉NUP85敲低對ERS、肝損傷及膠原沉積的抑制作用，表現為ERS標志物及纖維化標志物（α-SMA、Col1A1、Col3A1）表達回升，血清ALT、AST、ALP及羥脯氨酸含量增加，Masson和天狼猩紅陽性面積擴大（圖4G-P，圖S11H-Q）。以上結果表明，ERS是NUP85調控肝纖維化進程的關鍵介導因素。

為進一步闡明NUP85在肝纖維化中的作用，對RNA-seq數據進行聚類分析和KEGG通路富集分析。結果顯示，對照組與NUP85敲低組小鼠的基因表達模式存在顯著差異，其中MAPK信號通路是最顯著改變的通路（圖5A-B）。體內外驗證表明，在CCl?誘導的小鼠及TGF-β1刺激的LX-2細胞中，NUP85敲低可抑制ASK1、JNK、p38的磷酸化激活，而NUP85過表達則增強其磷酸化水平（圖5C-D，圖S12）。功能回補實驗進一步證實，腺病毒介導的ASK1過表達可逆轉NUP85敲低對HSC活化的抑制效應；而ASK1特異性抑制劑GS-4997則可消除NUP85過表達驅動的促活化效應（圖5E-L，圖S13I-L）。此外，NUP85對內質網應激的調控同樣依賴于ASK1信號通路。以上結果表明，ASK1是NUP85調控肝纖維化進程的關鍵下游靶點。

為闡明NUP85調控ASK1活性的機制，檢測了ASK1的泛素化和磷酸化水平。結果顯示，肝纖維化中ASK1的泛素化及磷酸化水平均升高，且NUP85可正向調控二者水平（圖S14A-C）。使用泛素化抑制劑TAK-243可阻斷NUP85對ASK1的調控作用，而廣譜激酶抑制劑無此效應，提示NUP85通過泛素修飾影響ASK1磷酸化活性（圖S14D-F）。通過IP-MS聯合RNA-seq篩選，結合免疫共沉淀和免疫熒光驗證，發現NUP85與去泛素化酶USP47存在直接相互作用，且NUP85可正向調控USP47的表達水平（圖6A-D，圖S15）。在TGF-β1誘導的LX-2細胞中進行NUP85與USP47的共敲低實驗，結果顯示同時敲低USP47可部分逆轉NUP85敲低對纖維化標志物（α-SMA、Col1A1、Col3A1）及內質網應激標志物（GRP78、ATF4、CHOP等）的抑制作用（圖6E-H，圖S16）。以上結果表明，NUP85通過與USP47結合，調控肝星狀細胞活化和內質網應激，從而促進肝纖維化進展。

為探究NUP85通過USP47調控ASK1泛素化的機制，首先驗證了USP47與ASK1的相互作用。免疫熒光和免疫共沉淀顯示，二者在LX-2細胞中共定位且直接結合（圖7A-C）。USP47過表達未影響ASK1的K48泛素化，但顯著抑制其K63泛素化（圖7D-E）。競爭性實驗表明，NUP85與ASK1競爭結合USP47的C19C結構域（圖7F-J，圖S14I-J）。通過LC-MS/MS鑒定出ASK1上四個潛在泛素化位點（K454、K458、K805、K1081），進一步構建點突變體進行功能驗證，發現K805R突變可阻斷NUP85和USP47對ASK1泛素化水平的調控，而其他位點突變無此效應（圖7K-N）。經質譜獨立驗證，K805為ASK1的關鍵泛素化位點（圖7O）。以上結果表明，NUP85通過USP47介導ASK1第805位賴氨酸的去泛素化修飾。

為進一步探究NUP85的治療潛力，通過虛擬篩選和分子對接發現天然產物羅漢果苷V（MV）可靶向NUP85，CETSA驗證了其結合能力（圖S17A-D）。10~80 μM的MV對LX-2細胞無毒性，且呈劑量依賴性抑制α-SMA和Col1A1表達（圖S17E-G）。在CCl?誘導的肝纖維化小鼠中，MV灌胃處理可降低血清轉氨酶水平、減輕膠原沉積、下調纖維化標志物及ERS標志物（圖S18）。為提高靶向性，構建了CREKA肽修飾的PEG化脂質體包載MV（CREKA-Lip/MV），粒徑約110 nm，球形均一，可持續釋放（圖8A-D）。體內成像顯示CREKA修飾顯著增強脂質體在纖維化肝臟中的富集（圖8E）。與游離MV相比，CREKA-Lip/MV更能有效降低血清ALT、AST、ALP及羥脯氨酸含量，減少膠原沉積，下調NUP85及纖維化標志物表達（圖8F-L，圖S19A-B）。體外實驗同樣顯示CREKA-Lip/MV較游離MV更顯著抑制LX-2細胞活化（圖S19C-G）。CCK-8及主要器官H&E染色證實其生物安全性良好（圖S20）。以上結果表明，CREKA-Lip/MV通過靶向HSCs中的NUP85安全有效地緩解肝纖維化。

本研究揭示了NUP85是肝纖維化的關鍵驅動因子。NUP85在纖維化肝組織中顯著上調，尤其在活化的HSCs中。敲低NUP85可減輕CCl?和BDL誘導的小鼠肝纖維化，過表達則加劇。機制上，NUP85競爭性結合去泛素化酶USP47，阻斷其對ASK1的K63去泛素化，增強ASK1磷酸化及下游JNK/p38信號，誘導內質網應激，促進HSCs活化。靶向NUP85的天然產物羅漢果苷V（MV）可抑制纖維化，而CREKA肽修飾的脂質體遞送MV（CREKA-Lip/MV）能靶向活化的HSCs，安全高效地緩解肝纖維化。NUP85-USP47-ASK1軸是肝纖維化治療的潛在新方向。

徐濤教授課題組長期致力于研究肝臟疾病中的分子機制與藥物干預，尤其是在肝臟炎癌轉化方面。課題組前期研究成果NUP85在MASH發病中的關鍵作用及分子機制已發表于Int. J. Biol. Sci. doi: 10.7150/ijbs.92337.徐濤教授，博導，博士后合作導師，銅陵市衛生健康委黨組成員副主任（掛職），入選2025年全球前2%頂尖科學家榜單（World's Top 2% Scientists），2025年安徽省青年基金A類項目（原省杰青），2024年安徽省高校杰青項目，安徽省教育廳優秀青年教師培育項目（重點類）、安徽醫科大學青年雙培工程人才。2019年獲得安徽省自然科學獎二等獎，安徽省教學成果一等獎。2020年獲得首屆安徽醫科大學復元科技新星。主持國家自然科學基金，安徽省自然科學基金，安徽省經濟發展重大課題，安徽省衛健委軟科學研究項目等18項科研項目。發表論文160篇，其中SCI第一作者/通訊作者80余篇，多篇刊登于中科院1區TOP期刊。兼任eGastroenterology 編委，《Oncologie》編委, World Journal of Integrated traditional and western Medicine（WJIM)青年編委，Medicine Advances青年編委，《中國藥理學通報》雜志青年編委,《現代藥物與臨床》雜志青年編委。課題組因發展需要，長期招聘博士及博士后科研人員，熱忱歡迎具有肝臟和生物學相關背景，有志于機制探索與藥物研究的青年才俊加入，也歡迎本科生和碩士生報考本課題組的研究生。

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