上海交大AM：新型多階段相變肽凝聚體，為智能生物材料開辟新途徑

在自然界中，生物分子凝聚體通過刺激觸發的多階段相變來響應外部應激。然而，現有的合成凝聚體通常依賴于溶劑或離子強度的變化來驅動多階段轉變，這種依賴性阻礙了在生理條件下實現連續、可逆的相變，從而限制了其在實際應用中的相編程能力。這一局限性主要源于合成系統缺乏動態模塊結構域，無法在全局相調控過程中協調其組裝途徑。

近日，上海交通大學馮傳良教授、宋陽副教授合作，報道了一類由低復雜度結構域衍生出的短肽合成子（分子量約1500道爾頓）。這些肽合成子在單體、自凝聚體、液晶和半結晶固體凝膠之間表現出熱可逆的四重相變。機理研究揭示，這些相變由凝聚和纖顫化兩種不同的組裝途徑共同調控，它們以協同和競爭的方式相互作用。通過修飾肽序列或分子結構，可以精確控制相變溫度，使多階段相變能夠在體溫（37°C）下由劑量依賴的病理信號（如乳酸）激活。相關論文以“Multistage Phase Programming in Fibrillated Peptide Coacervates”為題，發表在

Nature Communications

研究人員從天然低復雜度結構域中選擇了代表性的LARKS基序（-GGYGGG-），將其作為動態“粘合劑”整合到四苯乙烯標記的相分離肽中，合成了名為“LPD”的短肽衍生物。當將LPD（5 mg/ml）溶解在熱鹽水溶液中并以0.1°C/min的速率緩慢冷卻時，研究團隊觀察到一系列顯著的多階段相變：在55°C時，透明溶液中首先成核出亞穩的凝聚體液滴；隨著溫度降至53°C，這些液滴轉變為具有雙折射特性的液晶相；當溫度降至39°C以下時，最終固化為微米級凝膠。凝聚體和液晶相都表現出時間依賴的融合和光漂白后熒光恢復，證實了其液體特性，而凝膠相則不具備這些特性。掃描電鏡觀察顯示，凝聚體呈現無定形形態，而液晶相和凝膠相則呈現出纖維狀納米結構，且多數納米纖維具有優先取向，這與Onsager理論和液-液晶相分離模型相符。

圖1： LARKS編碼的肽衍生物在緩慢冷卻過程中表現出多階段相變。(a) 分子結構示意圖。明場和偏光顯微鏡揭示了從單體→凝聚體(b)→液晶(d)→固體凝膠(f)的多階段轉變。液滴融合用虛線圓圈標出。凝聚體(c)、液晶(e)和固體凝膠(g)的SEM圖像。(h和i)凝聚體、液晶和固體凝膠的FRAP測試（用羅丹明紅染色）。(j)液晶和固體凝膠的流變學性質，其中G'（儲能模量）和G"（損耗模量）作為角頻率的函數繪制。LPD濃度，5 mg/ml。

為了理解纖顫化在相變中的作用，研究人員使用淀粉樣蛋白特異性染料ThT對體系進行染色。隨著溫度從60°C降至30°C，分散相中的ThT熒光顯著增強，表明β-折疊纖維的形成增加。纖顫化動力學研究表明，在30-40°C的低溫條件下纖顫化進程更快。在整個熱循環過程中，分散相的雙折射強度與熱可逆纖顫化同步變化。通過系統改變LPD濃度，研究團隊繪制了相圖，顯示LLPS的臨界濃度約為0.07 mg/ml，且隨著濃度增加，凝聚體相的溫度窗口逐漸縮小，而液晶相的溫度窗口擴大，表明在高濃度下纖顫化在驅動相變中發揮更重要的作用。

圖2： 熱響應性纖顫化推動凝聚體中的無序-有序轉變。(a) 無序-有序轉變示意圖。(b) 熒光顯微鏡圖像揭示液滴內纖顫化（ThT，綠色）逐步增強，促進偏光下的液晶形成。虛線圓圈表示明場下的液滴位置。(c) 給定溫度下的纖顫化動力學研究。(d) LPDs的熱可逆纖顫化，如標準ThT熒光測定所示，與液晶的可逆形成相關(e)。(f) 顯示多階段轉變的相圖。冷卻速率，0.1°C/min。(g) 水混合物中纖顫化水平作為溫度和LPD濃度的函數量化。擬合曲線代表LLPS、液-液晶相分離和液-固相分離的計算邊界。重復次數：n = 6。

進一步研究表明，多階段相變受到“無序凝聚”和“有序纖顫化”兩種途徑的協同與競爭調控。在緩慢冷卻速率下（0.1-1°C/min），凝聚體首先成核，作為液體儲庫濃縮單體并啟動纖顫化，促進從凝聚體到液晶相的轉變。而在快速冷卻速率下（10-102°C/min），凝聚體的生長受到動力學抑制，產生亞微米級的小凝聚體，纖顫化過程在低溫下主導自組裝，形成“串珠狀”結構，導致雙折射強度顯著降低。

圖3： 凝聚和纖顫化的競爭性組裝途徑支配著多階段相變。(a–d)不同冷卻速率下LPDs的SLCM圖像和(e–h)纖絲（ThT，綠色）的分布。(i–l) SEM圖像顯示肽組裝體的形貌。隨著冷卻速率增加，液滴中的纖顫化水平相對于連續相中的纖顫化水平下降(m和n)。(o)不同冷卻速率下雙折射強度的變化，插圖顯示樣品的偏光顯微鏡圖像。重復次數：n = 6。

通過對LPD序列進行系統修飾，研究團隊實現了對多階段相變溫度的精確調控。將陽離子精氨酸替換為賴氨酸或組氨酸，LLPS的臨界溫度隨陽離子-π/π-π相互作用的強度變化而改變，液晶和凝膠的形成溫度也同步變化。將陰離子天冬氨酸替換為谷氨酸或谷氨酰胺，對相變溫度影響較小。在LARKS基序中替換芳香族氨基酸，將酪氨酸替換為疏水性更強的苯丙氨酸會顯著提高各相變溫度，而替換為親水性更強的絲氨酸則降低相變溫度，但絲氨酸的小側鏈允許更緊密的堆積，在凝膠相中表現出更高的纖顫化程度。

圖4： 基于序列的調控控制多階段相變的臨界溫度。(a–c) LPD中陽離子氨基酸的取代。(a) 光密度測量作為冷卻函數。顯示了不同取代的明場和偏光顯微鏡圖像(b和c)。(d–f) 離子氨基酸的替換對相變影響最小。(g–i) LARKS中芳香族氨基酸的替換。LPD濃度固定為5 mg/ml。冷卻速率，1°C/min。比例尺，10 μm。

最后，研究團隊探索了這些LPDs在疾病信號檢測和藥物釋放方面的應用潛力。乳酸是一種疾病標志物，在病變組織中過表達。研究發現，TPE-RGGYGGGSDG和TPE-HGGYGGGSDG兩種肽對乳酸表現出不同的敏感性：前者在30、100和300 mM乳酸濃度下發生凝膠→液晶→凝聚體→單體的逐步相變，而后者在2 mM和5 mM的低濃度乳酸下即可實現液晶→凝聚體→單體轉變，敏感性提高約50倍。在載藥釋放實驗中，預先裝載阿霉素的TPE-RGGYGGGSDG凝膠在不同乳酸濃度下表現出依賴相態的藥物釋放動力學。

圖5： LPDs被編程為對疾病信號檢測和響應性藥物釋放具有可調敏感性。(a) 信號觸發的多階段相變示意圖。(b) TPE-RGGYGGSDG和(c) TPE-HGGYGGSDG在多階段相變過程中對乳酸表現出不同的敏感性。比例尺，25 μm。(d和e)通過改變乳酸濃度分別檢測兩種LPD組裝體中的纖顫化水平。(f) TPE-RGGYGGSDG組裝體響應乳酸釋放抗腫瘤藥物阿霉素。LAC濃度分別為0、30、100、300 mM。所有實驗均在37°C、150 mM NaCl溶液中進行。重復次數：n = 4。

總結與展望：本研究展示了一類具有多階段相變的LARKS編碼肽衍生物，其特征是從溶解單體到自凝聚體、再到液晶、最終到固體凝膠的逐步演變。定量分析揭示了這些轉變由纖顫化和凝聚兩種組裝途徑以協同和競爭的方式共同驅動。通過改變LPD序列和化學修飾，可以精確調控多階段相變，實現在37°C下對熱信號和生化信號（如乳酸）的程序化、多步驟響應。盡管LPDs為智能相編程提供了一個有前景的平臺，但要推進其實際應用，仍需解決幾個挑戰。未來的研究應集中于闡明其對生化信號響應的特異性，減少非特異性吸附分子的干擾，并最終在復雜組織環境和疾病模型中驗證其作為智能生物材料的功能。