Adv Sci：基于結(jié)構(gòu)色納米腔的智能無染色組織學(xué)分析

論文信息：

Q. Chen, Y. Ren, L. Hu, Y. Li, W. Liang, J. Wang, H. Gao, X. Wang, J. Li, Q. He, Y. Zhu, H. Hu, Q. Zhan, I. Gallouzi, J. Merzaban, D. Wang, Z. Du, X. Gu, Q. Gan, Intelligent Stain‐Free Histology on Structural Colorimetric Nanocavities, Advanced Science (2026) e14340.

論文鏈接：

https://doi.org/10.1002/advs.202514340.

研究背景

現(xiàn)代病理診斷離不開顯微鏡下對(duì)組織形態(tài)和顏色分布的判斷，但臨床金標(biāo)準(zhǔn)的蘇木精-伊紅染色不僅耗時(shí)費(fèi)力、成本高，還會(huì)因?yàn)槿疽簼舛炔▌?dòng)和試劑質(zhì)量差異帶來一致性問題，而且診斷質(zhì)量在很大程度上依賴病理醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)與主觀判斷，這在數(shù)字化與個(gè)體化醫(yī)療越來越強(qiáng)調(diào)標(biāo)準(zhǔn)化、可復(fù)制的背景下就成了瓶頸，于是人們開始探索免染色的組織學(xué)成像來降低化學(xué)染色的成本與勞動(dòng)強(qiáng)度，不過已有方案要么依賴昂貴復(fù)雜的中紅外或其他先進(jìn)顯微系統(tǒng)，要么像“虛擬染色”那樣需要大量高質(zhì)量訓(xùn)練數(shù)據(jù)和高端成像設(shè)備，最近出現(xiàn)的等離激元納米孔陣列載玻片雖然能用常見明場(chǎng)顯微鏡在無標(biāo)記切片上做出可用于判別的顏色對(duì)比，但其金屬薄膜納米圖案的制備依舊昂貴復(fù)雜，難以規(guī)模化進(jìn)入醫(yī)院常規(guī)流程，因此迫切需要一種更便宜、更易制造、又能直接融入現(xiàn)有臨床硬件并適合AI大規(guī)模數(shù)據(jù)采集的免染色組織學(xué)成像平臺(tái) 。本文 開發(fā)了干涉納米腔平面結(jié)構(gòu)，只需簡單的鍍膜便可實(shí)現(xiàn)各種顏色。將病理切片貼上去之后，免去了傳統(tǒng)染色步驟，可直接看到對(duì)比度清晰的細(xì)胞圖，大幅度減少制樣時(shí)間和花費(fèi)。和人工智能結(jié)合，可以做到快速準(zhǔn)確診斷。

研究內(nèi)容

病理診斷里最常見的套路還是看 H&E 染色切片，但這個(gè)流程既費(fèi)時(shí)費(fèi)力，又容易受試劑濃度、染色液質(zhì)量和操作一致性影響，結(jié)果還高度依賴病理醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)，所以在追求標(biāo)準(zhǔn)化、數(shù)字化和更低成本的臨床環(huán)境里就顯得有點(diǎn)“老派又昂貴”了。過去十年出現(xiàn)過不少免染色思路，比如中紅外光譜化學(xué)成像、虛擬染色等，但往往需要更復(fù)雜昂貴的成像設(shè)備或海量訓(xùn)練數(shù)據(jù)；即便是納米光子芯片這種能在普通明場(chǎng)顯微鏡下做顏色對(duì)比的方案，也常被高成本的納米加工卡住了。作者因此把目標(biāo)定得很直接，用更便宜、更容易量產(chǎn)的平面納米腔結(jié)構(gòu)來做免染色組織學(xué)成像，并把后續(xù) AI 輔助篩查也一并納入同一條工作流里。

圖 1 基于硅基結(jié)構(gòu)色比色納米腔（NOS）載玻片的先進(jìn)無染色組織學(xué)分析。

(a) 智能組織學(xué)診斷示意圖，插圖為分層 NOS 載玻片結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。

(b) 12 片 6 英寸 NOS 晶圓的光學(xué)照片，插圖展示干涉的光學(xué)機(jī)理。

(c) 對(duì)應(yīng)的反射光譜。右上角標(biāo)注了 Si?N? 層厚度（單位：nm）；下方部分給出了未覆蓋 Si?N? 層的硅晶圓反射情況。

(d、e) 玻璃載玻片上連續(xù)切取、名義厚度為 2 μm 的人結(jié)直腸上皮組織切片的對(duì)比顯微圖像： (d) 未進(jìn)行 H&E 染色；(e) 進(jìn)行了 H&E 染色。

(f–k) 不同顏色的 NOS 載玻片，其中頂層 Si?N? 厚度分別為： (f) 268 nm，(g) 243 nm，(h) 197 nm，(i) 158 nm，(j) 111 nm，(k) 85 nm。

所有圖像均使用 10× 物鏡（NA = 0.3）采集。圖 d–k 的比例尺：50 μm。

圖1主要在講“底座”到底是什么，以及它為什么能讓組織在不染色的情況下出現(xiàn)可讀的顏色對(duì)比。NOS 玻片本質(zhì)上就是在硅片上沉積一層納米級(jí)厚度的氮化硅，通過反射光的薄膜干涉產(chǎn)生結(jié)構(gòu)色，調(diào)一調(diào)氮化硅厚度就能得到一系列不同的底色與反射譜共振位置。然后作者把同一來源的結(jié)直腸上皮連續(xù)切片分別放在普通玻片和不同顏色的 NOS 玻片上做對(duì)比，能直觀看到 NOS 提供的顏色層次明顯更豐富，組織形態(tài)細(xì)節(jié)也更容易被“顏色差”帶出來，為后面定量分析和診斷鋪路。

圖 2 硅基結(jié)構(gòu)色比色納米腔（NOS）載玻片的分析。

(a) 健康與癌變結(jié)腸組織的折射率（RI）分布圖灰度圖像；灰度值與 RI 對(duì)應(yīng)。比例尺：10 μm。

(b) (a) 中組織 RI 值的統(tǒng)計(jì)分布。

(c) 在 CIE 色度圖上模擬得到：厚度 0.5 μm、折射率 n = 1.22–1.47 的材料在綠色 NOS 載玻片上的顏色位置變化。

(d) 在 CIE 色度圖上模擬得到：厚度 1 μm、折射率 n = 1.22–1.47 的材料在綠色 NOS 載玻片上的顏色位置變化。

(e) 人結(jié)直腸上皮組織切片的顯微圖像，標(biāo)出用于計(jì)算與分析的健康區(qū)域（藍(lán)框）和癌變區(qū)域（紅框）。玻璃載玻片上的所有圖像均由配備 20× 物鏡（NA = 0.75）的 Leica Aperio 掃描儀獲取；兩幅 NOS 圖像則使用 4× 物鏡（NA = 0.13）拍攝。比例尺：200 μm。

(f) (e) 中綠色 NOS 載玻片對(duì)應(yīng)區(qū)域的微區(qū)多光譜結(jié)果。

(g) 健康區(qū)域（藍(lán)色，上面板）與癌變區(qū)域（紅色，下面板）的 CIELAB 空間分布。

(h) 健康/癌變點(diǎn)云之間云點(diǎn)交并比（IoU）的小提琴圖（中間虛線表示中位數(shù)，上/下虛線表示四分位距 IQR；每組 n = 25）。采用雙側(cè)獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)，玻璃 vs. NOS 的 p 值為 1.94×10?1?，H&E vs. NOS 的 p 值為 5.80×10?1?，二者在 α = 0.0001 水平上均具有顯著性。

圖2把“為什么會(huì)變色”這件事拆開來做定量解釋，并證明這種顏色差確實(shí)能更好地區(qū)分健康與癌變區(qū)域。作者先用光學(xué)衍射層析測(cè)了組織的折射率分布，發(fā)現(xiàn)健康與癌變上皮的折射率統(tǒng)計(jì)分布峰值有明顯差異；再結(jié)合 AFM 測(cè)到的真實(shí)厚度范圍，用傳輸矩陣法去模擬在不同折射率與厚度下 NOS 顏色在 CIE 色度圖上的漂移，說明很小的折射率或厚度變化就能帶來人眼可感知的顏色差。最后他們把實(shí)際圖像做成像素級(jí) CIELAB 點(diǎn)云，用點(diǎn)云重疊度 IoU 來量化健康/癌變的顏色分離程度，結(jié)果顯示 NOS 上的點(diǎn)云分離優(yōu)于未染色玻片和傳統(tǒng) H&E。

圖 3 H&E 染色與 NOS 載玻片圖像中器官與組織病理連續(xù)切片的比較。

(a) 健康結(jié)直腸上皮，并給出放大的上皮細(xì)胞圖像。

(b) 結(jié)直腸腺癌及低分化腫瘤。

(c) 健康/癌浸潤的結(jié)直腸固有層。

(d) 健康/癌浸潤的結(jié)直腸肌層。

(e) 健康/癌變?nèi)橄伲ㄗ罅校⒎危ㄖ辛校┡c甲狀腺組織切片（右列）。

(f) 一例結(jié)直腸病例及其診斷結(jié)果。

玻璃載玻片上的所有圖像均由配備 20× 物鏡（NA = 0.75）的 Leica Aperio 掃描儀獲取；兩幅 NOS 圖像則使用 10× 物鏡（NA = 0.3）拍攝。圖 a–e 的比例尺：100 μm；圖 f 的比例尺：500 μm。

圖3是在回答“這東西是不是只對(duì)某一種組織好用”以及“病理醫(yī)生能不能直接拿它做判斷”。他們拿了多器官樣本做連續(xù)切片對(duì)照，在結(jié)直腸上皮、固有層、肌層等不同組織結(jié)構(gòu)里，NOS 圖像能復(fù)現(xiàn) H&E 下關(guān)鍵的腺體結(jié)構(gòu)、杯狀細(xì)胞缺失、細(xì)胞異型性、浸潤邊界等診斷要點(diǎn)，并把這種能力擴(kuò)展到乳腺、肺和甲狀腺等組織。更關(guān)鍵的是還做了盲法對(duì)比讀片，在一批結(jié)直腸病例里，用 NOS 圖像給出的區(qū)域劃分和 H&E 參考結(jié)果高度一致，用一致率和 Kappa 系數(shù)把“能用”這件事量化到了接近臨床可接受的水平。

圖 4 用于輔助評(píng)估的機(jī)器學(xué)習(xí)算法及其結(jié)果。

(a) AI 算法訓(xùn)練流程與輔助評(píng)估性能測(cè)試流程。

(b) 在測(cè)試數(shù)據(jù)集上測(cè)試得到的混淆矩陣。

(c) 模型的受試者工作特征（ROC）曲線，AUC 達(dá)到 0.987。

(d) 病理學(xué)家基于 H&E 染色圖像對(duì)一張結(jié)直腸組織切片給出的病理診斷結(jié)果。

(e) 在與 (d) 對(duì)應(yīng)的、NOS 載玻片上的連續(xù)無染色切片中，DenseNet121 模型給出的判別結(jié)果。比例尺：500 μm。

圖4把前面“可讀的結(jié)構(gòu)色”順手接到了 AI 上，展示了一個(gè)真正能跑起來的輔助評(píng)估流程。作者用 NOS 圖像切塊構(gòu)建結(jié)直腸健康/癌變上皮數(shù)據(jù)集，按病人級(jí)別劃分訓(xùn)練集和測(cè)試集，訓(xùn)練 DenseNet121 這類 CNN 做二分類，在測(cè)試集上給出高準(zhǔn)確率以及很高的 AUC，并用混淆矩陣和 ROC 曲線把模型性能說清楚。更貼近臨床的是他們把模型輸出做成整片區(qū)域的顏色標(biāo)注，去和病理醫(yī)生在 H&E 上圈出的病灶范圍對(duì)齊，結(jié)果顯示模型在大尺度區(qū)域分割上也能較好復(fù)現(xiàn)人工標(biāo)注，而且推理速度足夠快，適合做批量篩查和預(yù)分診。

結(jié)論與展望

文章提出一種可量產(chǎn)、低成本的免染色病理成像方案，在硅基底上沉積納米厚度氮化硅形成結(jié)構(gòu)色納米腔(NOS)載玻片，用普通明場(chǎng)顯微鏡即可把無標(biāo)記組織切片的微小厚度與折射率差異轉(zhuǎn)化為顯著顏色對(duì)比。作者通過光學(xué)衍射層析獲得折射率分布、用AFM測(cè)厚，并以傳輸矩陣法解釋不同組織在CIE色度空間的漂移，證明NOS能比常規(guī)未染色玻片與H&E在顏色點(diǎn)云上更好地區(qū)分健康與癌變區(qū)域。多器官連續(xù)切片對(duì)照顯示NOS圖像可呈現(xiàn)腺體結(jié)構(gòu)、杯狀細(xì)胞變化與浸潤邊界等關(guān)鍵病理特征，盲法讀片一致性接近H&E。進(jìn)一步構(gòu)建結(jié)直腸數(shù)據(jù)集訓(xùn)練CNN實(shí)現(xiàn)高AUC分類，并生成整片病灶熱圖，展示了可直接接入數(shù)字病理與AI篩查的臨床工作流。