166個單基因自閉癥有了治療方向！中國科學(xué)家發(fā)明新技術(shù)——

VOL 3742

與單基因突變相關(guān)的自閉癥治療，有可能進(jìn)入快車道。

2026年1月27日，國際頂級期刊《細(xì)胞》（Cell）雜志在線發(fā)表中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院路中華教授團(tuán)隊的最新研究成果。

該團(tuán)隊與北京大學(xué)第一醫(yī)院合作，開發(fā)了帶有易位連接的腺相關(guān)病毒（AAVLINK），使穩(wěn)定、高效的大基因遞送成為可能。

腺相關(guān)病毒（AAV）是目前基因治療中最常見的基因遞送載體，但受限于其有限的包裝容量（極限容量約為 4.7kb 至 5.0kb），目前已知的自閉癥風(fēng)險基因中，有 37.5% 的基因都大到無法用單個 AAV 運送。

路中華團(tuán)隊開發(fā)的AAVLINK及其迭代版本AAVLINK2.0，利用一種叫作“ Cre/lox 介導(dǎo)的分子間 DNA 重組“技術(shù)，將大基因拆分為2-3段，用2-3個AAV同時運送到細(xì)胞內(nèi)后重組，從而突破單個AAV容量不足的問題。

利用該技術(shù)，路中華團(tuán)隊構(gòu)建了一個涵蓋193 個與遺傳性疾病相關(guān)的大基因、五種基于 CRISPR 的基因工具的載體庫，其中166個是與自閉癥相關(guān)的基因，包括SHANK3、CHD8、SYNGAP1、SCN1A等。

其中，SHANK3（費蘭-麥克德米德綜合征）、 SCN1A（Dravet 綜合征）等已在試驗階段的基因療法，有可能因此縮短臨床應(yīng)用的時間。

文 | 譚萬能

AAVLINK方案示意圖、迭代過程、動物實驗結(jié)果、198個基因庫和5個可遞送的基因編輯工具（圖源：doi.org/10.1016/j.cell.2025.12.039）

一個高效、穩(wěn)定、安全的基因“快遞”系統(tǒng)的誕生

如果把基因治療中的基因遞送比作一次“送快遞”，那么腺相關(guān)病毒（AAV）無疑是目前生物醫(yī)藥界公認(rèn)的金牌快遞員。它安全、不致病，還能長期駐留在細(xì)胞里工作。

但這位金牌快遞員有一個致命的弱點：它的“隨身行李箱”太小了。

AAV 是一種非常微小的病毒，它的衣殼空間決定了其裝載基因的極限容量約為 4.7kb 至 5.0kb。但許多重大的遺傳性疾病，其致病基因都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過這個荷載：

● 杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）：其所需的抗肌萎縮蛋白基因長達(dá) 14kb，是 AAV 容量的近 3 倍。

● Dravet 綜合征（嬰兒嚴(yán)重癲癇）：所需的 SCN1A 鈉通道基因達(dá)到 6kb。

● 自閉癥譜系障礙（ASD）：統(tǒng)計顯示，在 ASD 風(fēng)險基因中，有 37.5% 的基因都大到無法用單個 AAV 運送。

為了把這些大基因遞送到目標(biāo)細(xì)胞，科學(xué)家想了很多辦法，比如蛋白質(zhì)反式剪接 （Intein）、RNA 反式剪接 （StitchR） 以及傳統(tǒng) DNA 重組 （tsAAV）。

但這些方法在DNA拆分位點選擇的靈活性、復(fù)原的效率、產(chǎn)物的純凈度等方面，都或多或少的存在不足。

為克服這些缺陷，路中華團(tuán)隊開發(fā)了一種名為AAVLINK（AAV 易位銜接）的新策略。

它借鑒了類似“宜家家具”的運輸哲學(xué)，將一個大基因拆分為兩個（雙載體）甚至三個（三載體）較小的片段，分別裝入不同的 AAV“快遞箱”中。

但這也帶來了一個新的技術(shù)挑戰(zhàn)：如何在細(xì)胞核這個微觀的“房間”里，把拆散的基因嚴(yán)絲合縫地拼回去？

AAVLINK 利用 Cre/lox 介導(dǎo)的分子間 DNA 重組技術(shù)，通過重組酶（Cre）去識別并操作特定的識別位點（loxP），從而實現(xiàn)對 DNA 片段的精準(zhǔn)剪切、倒置或易位連接。

AAVLINK流程示意圖（圖源：http://aavlink.com/）

具體步驟如下：

1. 分頭入戶：攜帶不同基因片段的 AAV 同時感染同一個細(xì)胞。

2. 召喚焊工：載體中攜帶的Cre重組酶，像一個精準(zhǔn)的焊接工，能識別 DNA 兩端的特定接口（lox位點），將兩段分離的 DNA 物理連接在一起。

3. 無痕精修：焊接完成后，DNA 上會留下一段多余的接口痕跡（人工內(nèi)含子）。此時，細(xì)胞自帶的“剪接系統(tǒng)”會像裝修工一樣，把這段多余痕跡切除，最終在 mRNA 水平上復(fù)原出全長基因。

實驗數(shù)據(jù)顯示，這種 DNA 維度的重組效率極高。在修復(fù)自閉癥相關(guān)的 Shank3基因時，AAVLINK 的效率比現(xiàn)有的蛋白質(zhì)拼接技術(shù)（Intein）高出了 36.6 倍。

為了防止Cre重組酶在完成基因重組后還駐留在細(xì)胞內(nèi)，并錯誤地切割人體自身的基因組（偽位點效應(yīng)），路中華團(tuán)隊在驗證了AAVLINK方案的可行性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上，對它的安全性進(jìn)行了升級。

AAVLINK的迭代過程（圖源：http://aavlink.com/）

在升級版的 AAVLINK 2.0 版本中，研發(fā)團(tuán)隊為 Cre 設(shè)計了“任務(wù)完成即自毀”的三重保險：

●第一重：斷電（表達(dá)自終止）。基因重組一旦完成，Cre 的基因編碼區(qū)就會自動與供能元件（PolyA）斷開，使其無法繼續(xù)產(chǎn)生新的酶。

●第二重：靜音（超弱啟動子）。放棄強(qiáng)啟動子，改用超弱啟動子 SCP1。這就像讓安裝工“悄悄進(jìn)村”，只產(chǎn)生剛好夠用的微量酶，絕不驚動免疫系統(tǒng)。

●第三重：銷毀（降解標(biāo)簽）。這是最核心的改進(jìn)?？茖W(xué)家給 Cre 貼上了一個“垃圾標(biāo)簽”（UDeg3a）。細(xì)胞內(nèi)的清潔工（蛋白酶體）一看到這個標(biāo)簽，就會在 Cre 完成工作后迅速將其降解銷毀。

結(jié)果顯示，在 2.0 版本中，重組發(fā)生后 Cre 的殘留水平低于檢測限。

166個自閉癥基因的“拆裝”方案

為了驗證這一技術(shù)的可行性，路中華團(tuán)隊針對兩種難治性遺傳病進(jìn)行了動物實驗。

1. 費蘭-麥克德米德綜合征（PMS）

費蘭-麥克德米德綜合征（PMS）是一種嚴(yán)重的神經(jīng)發(fā)育疾病，由 SHANK3 基因缺失引起（該基因長 5.4kb，超載）。

利用 AAVLINK 將其拆分遞送入小鼠腦部后，不僅恢復(fù)了關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，小鼠的重復(fù)刻板行為（如不停理毛）也消失了，社交功能得到恢復(fù)。

SHANK3是最早有基因治療方案的自閉癥風(fēng)險基因，其核心專利的持有者馮國平教授也是路中華留學(xué)杜克大學(xué)時的博士生導(dǎo)師。AAVLINK方案的面世，或?qū)⒓铀貾MS基因療法的落地。

2. Dravet 綜合征

Dravet 綜合征是一種致死率極高的嬰兒期癲癇，致病基因 SCN1A 長達(dá) 6.0kb。在實驗中，未治療的患病小鼠生存率不足 50%。

而經(jīng)過 AAVLINK 全身治療后，小鼠的生存率飆升至近 90%，神經(jīng)元放電功能恢復(fù)正常。

包括上述兩個基因在內(nèi)，路中華團(tuán)隊從 SFARI Gene 數(shù)據(jù)庫（全球最權(quán)威的自閉癥基因數(shù)據(jù)庫）中篩選了166符合以下三個標(biāo)準(zhǔn)的基因，并構(gòu)建了”運輸“和”拆裝“方案：

●單基因致病性：絕大多數(shù)單基因自閉癥是由功能缺失（Loss-of-Function, LoF）或單倍體不足（Haploinsufficiency）引起的 。這意味著只要這個特定基因的一個副本壞了，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)不夠用，就會導(dǎo)致疾病。

●大片段限制：編碼序列（CDS）長度超過 4 kb 。這類基因以往無法裝入單個 AAV（約 4.7 kb 上限），因此是基因治療的“處女地”。

●臨床適用性：適合通過“基因替代（Gene Replacement）”療法進(jìn)行修復(fù)，即通過 AAVLINK 送入一個正常的基因副本 。

198個基因“拆裝”方案及效果驗證（圖源：doi.org/10.1016/j.cell.2025.12.039）

具體包括SFARI三個得分等級，即Score 1-3的基因。比如極高置信度（SFARI Score 1）里的：

●SHANK3：導(dǎo)致費蘭-麥克德米德綜合征（PMS）的核心基因。它是突觸后致密區(qū)的關(guān)鍵支架蛋白，其缺失是單基因自閉癥最典型的代表之一 。

●CHD8：一種染色質(zhì)重塑因子。CHD8 突變被認(rèn)為是自閉癥中最常見的單基因致病因素之一。

●SYNGAP1：編碼一種在突觸中調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性的酶，缺失會導(dǎo)致智力障礙和自閉癥 。

●SCN1A：導(dǎo)致Dravet 綜合征（嬰兒嚴(yán)重癲癇）的核心基因。

●SCN2A：編碼鈉通道蛋白。其功能缺失突變通常與自閉癥和發(fā)育遲緩相關(guān) 。

●RAI1：導(dǎo)致史密斯-馬吉利綜合征（Smith-Magenis Syndrome），患兒表現(xiàn)出明顯的自閉癥行為特征 。

●CACNA1C：與 Timothy 綜合征相關(guān)，該綜合征有極高比例的患兒被診斷為自閉癥 。

自閉癥基因治療的新時代來臨？

除了直接將大基因遞送到細(xì)胞內(nèi)以外，AAVLINK也支持將基因編輯工具的直接遞送。例如高精度的堿基編輯器（BE）和先導(dǎo)編輯器（PE），它們的體積通常在 5kb 到 6.5kb 之間，以前的單個AAV也根本拉不動。

有的時候，為了能夠讓AAV將編輯器運到細(xì)胞中，研究人員還不得不針對編輯器進(jìn)行專門設(shè)計。比如我們之前報道的仇子龍教授團(tuán)隊針對MEF2C基因的基因編輯治療，就采用類似的方法。

AAVLINK 2.0 系統(tǒng)成功復(fù)原了大型堿基編輯器 ABE8e 和 YE1-BE4max 。

在針對高血脂癥靶點 Pcsk9 的實驗中，AAVLINK-ABE8e 在小鼠體內(nèi)的 A-to-G 編輯率達(dá)到了驚人的 16%，并顯著降低了血液中的 PCSK9 蛋白水平。

同時，AAVLINK 的出現(xiàn)，也使得標(biāo)準(zhǔn)的 SpCas9 工具完整遞送成為可能。

通過雙載體拆分 SpCas9（切點于 c.2682），使得兩枚載體可以各自攜帶強(qiáng)大的啟動子和多條 sgRNA 。

實驗證明，重組后的 SpCas9 在小鼠肝臟中實現(xiàn)了對 Rosa26 位點的精準(zhǔn)切割，成功率與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染水平相當(dāng) 。

AAVLINK目前支持SpCas9, ABE8e, YE1-BE4max，dCas9-VPH和CRISPRoff這五個基因編輯工具的遞送，實現(xiàn)體內(nèi)突變的修復(fù)。

目前，包括166個自閉癥基因在內(nèi)的198個基因和5個基因編輯工具，均可在團(tuán)隊構(gòu)建的名為 AAVLINK Resource （http://aavlink.com/）的網(wǎng)站查詢具體“拆裝方案”，涵蓋自閉癥、肌肉萎縮癥、耳聾等多個領(lǐng)域。

需要提醒讀者的是，雖然該技術(shù)的出現(xiàn)可能加快自閉癥基因治療的步伐，也需要注意，單純因為功能缺失、拷貝數(shù)變異等原因?qū)е碌淖蚤]癥，占自閉癥群體的總量并不多。

同時該方法目前也僅僅完成動物試驗，且試驗的多是神經(jīng)特異性啟動子（雖然對自閉癥來說是好事），具體的方法，在靈長類生物或者人體內(nèi)的協(xié)同轉(zhuǎn)導(dǎo)效率如何，能否穩(wěn)定高效安全的實施，也有待檢驗。

遞送內(nèi)容

類比

工作原理

目標(biāo)

基因片段

（cDNA）

“加裝備件”

將一個正常的基因副本送入細(xì)胞，讓細(xì)胞根據(jù)這個副本生產(chǎn)缺失的蛋白質(zhì)。

補(bǔ)償缺失或功能異常的基因。

基因編輯工具（CRISPR）

“現(xiàn)場手術(shù)”

遞送一套“手術(shù)器材”（如Casd9剪刀和sgRNA導(dǎo)航）直接對細(xì)胞內(nèi)原有的錯誤DNA進(jìn)行剪切、刪除或修正。

永久性地更改細(xì)胞自身的基因組。

基因治療的兩種方法

但該方法的出現(xiàn)，將載體技術(shù)與編輯工具這兩個過去經(jīng)常被視為兩個獨立的研發(fā)方向，實現(xiàn)了有機(jī)結(jié)合，即以后的基因治療，不管是遞送基因片段，還是遞送編輯工具，在載體方面，會有一個穩(wěn)定高效的選擇。

*本文經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院松江研究院資深研究員仇子龍審核發(fā)布。

參考資料：

1. https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.12.039

2. https://www.eurekalert.org/news-releases/1114326

3. http://aavlink.com/

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