Genome Biol |?CAS9 切割不僅改序列，還改“記憶”：李墨團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn) DNA 斷裂重塑表觀遺傳狀態(tài)

CRISPR-Cas9 引發(fā)的 DNA 雙鏈斷裂不僅改變遺傳序列，還會(huì)擾亂局部表觀遺傳信息。

近日，Genome Biology在線發(fā)表了阿卜杜拉國(guó)王科技大學(xué)（KAUST）李墨團(tuán)隊(duì) 題為CRISPR-Cas9-induced double-strand breaks disrupt maintenance of epigenetic information的 的重要研究，系統(tǒng)揭示：Cas9 誘導(dǎo)的雙鏈斷裂（double-strand break, DSB）會(huì)導(dǎo)致 DNA 甲基化維持失敗，產(chǎn)生穩(wěn)定且可遺傳的表觀遺傳重塑。這一發(fā)現(xiàn)填補(bǔ)了基因編輯領(lǐng)域一項(xiàng)長(zhǎng)期空白，并對(duì)未來臨床基因治療的安全性評(píng)估具有關(guān)鍵意義。

CRISPR–Cas9 通過制造精準(zhǔn)的 DNA 雙鏈斷裂，實(shí)現(xiàn)靶向修復(fù)和基因編輯。過去的研究集中在 DSB 引發(fā)的序列層面突變，如插入、缺失和結(jié)構(gòu)變異； 然而 DSB 是否會(huì)影響 DNA 的表觀遺傳狀態(tài)，卻一直缺乏直接證據(jù) 。

DNA 甲基化作為表觀遺傳的重要機(jī)制之一，是 維持 細(xì)胞身份、調(diào)控發(fā)育、保證基因組穩(wěn)定性的重要方式。例如，印記基因的甲基化差異控制父源或母源等位基因的特異表達(dá)；而 CG 島（ CGI ）超甲基化則是多種癌癥的典型特征【1-5】。目前，大多數(shù)甲基化研究依賴亞 硫酸鹽轉(zhuǎn)化結(jié)合基因組 PCR 和短讀長(zhǎng)測(cè)序，無法同時(shí)觀察天然 DNA 序列與其甲基化狀態(tài)，也難以在單分子和單等位基因?qū)用胬斫?DSB 對(duì)表觀遺傳的影響【6-8】。

在本研究中 ， 李墨團(tuán)隊(duì)借助納米孔 （Oxford Nanopore） 長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù) ， 并結(jié)合團(tuán)隊(duì)改良的 Cas9-assisted targeted sequencing (CTS) 流程 ， 直接捕獲細(xì)胞內(nèi) DSB 修復(fù)后的天然 DNA 分子 ， 實(shí)現(xiàn)了 單分子、單等位基因水平的序列 – 甲基化雙層解析 。通過對(duì)多個(gè)基因組背景（H1 hESC 的印記 DMR、異染色質(zhì)高甲基化區(qū)域，以及 RKO 細(xì)胞系的 MLH1 超甲基化區(qū)域）進(jìn)行高覆蓋度測(cè)序（≥242×），研究團(tuán)隊(duì)同時(shí)獲得了斷裂前后 DNA 序列變異與單堿基分辨率甲基化信息。結(jié)果顯示，在印記基因（SNRPN、PEG10）、異染色質(zhì)區(qū)域（UCA1、CRCT1）以及腫瘤相關(guān)基因（MLH1）等多個(gè)模型中，Cas9 切割均引起 局部 DNA 甲基化顯著下降 。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，甲基化異常具有明顯的單等位基因和單分子特異性，呈現(xiàn)出 Opposite 和 Mosaic 等典型模式，在切割組中遠(yuǎn)高于未切割對(duì)照。

機(jī)制研究指出，甲基化丟失可由三類事件驅(qū)動(dòng)：① 同源重組導(dǎo)致的等位基因交換；② 大型結(jié)構(gòu)變異引發(fā)的序列缺失【9-14】；③ 斷裂修復(fù)過程中 DNA 甲基化維持失敗 。令人意外的是，超過 80% 的異常甲基化讀段并未伴隨任何結(jié)構(gòu)變異，提 示 第三類機(jī)制最為普遍，即 DSB 本身已足以破壞細(xì)胞對(duì)甲基化狀態(tài)的忠實(shí)維護(hù) 。

更重要的是，研究團(tuán)隊(duì)在單細(xì)胞克隆中發(fā)現(xiàn)，這些由 DSB 導(dǎo)致的甲基化改變 可 在細(xì)胞世代間穩(wěn)定遺傳 ，表現(xiàn)為長(zhǎng)期“表觀遺傳記憶”。此外，在未編輯樣本中，團(tuán)隊(duì)通過識(shí)別自然產(chǎn)生的微缺失事件（≥2 bp），觀察到缺失周圍同樣存在甲基化下降并隨距離恢復(fù)的模式，進(jìn)一步證 明 DSB 修復(fù)本身即是擾亂表觀遺傳環(huán)境的一般性機(jī)制，而非 Cas9 特有產(chǎn)物 。

該研究揭示的現(xiàn)象對(duì)基礎(chǔ)生物學(xué)與醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化均具有深遠(yuǎn)意義。DSB 不僅塑造 DNA 序列，還可能通過重寫 DNA 甲基化影響基因表達(dá)、印記調(diào)控、細(xì)胞命運(yùn)以及癌癥表觀遺傳狀態(tài)。隨著基因編輯療法（如近期獲批的鐮刀型貧血 CRISPR 療法）進(jìn)入臨床， 表觀遺傳層面的安全性評(píng)估應(yīng)成為未來關(guān)注重點(diǎn) 。

KAUST 李墨副教授 為該論文 通訊作者 。 KAUST 團(tuán)隊(duì) 還包括 王夢(mèng)鴿博士 （共同 第一作者 ） 張櫻子 博士 （共同 第一作者 ） ，畢重偉 博士（現(xiàn) 任 吉林大學(xué) 助理 教授 ， 共同作者 ） 。

https://link.springer.com/article/10.1186/s13059-025-03851-9

制版人：十一

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