動物行為實驗手冊丨大小鼠被動回避實驗測試方法及注意事項

被動回避實驗是一種用于評估嚙齒類動物長期記憶和情緒性學(xué)習(xí)的行為學(xué)方法。被動回避實驗是一種快速且可靠的方法，可用于評估基因修飾或藥理干預(yù)（如東莨菪堿給藥）對情緒性學(xué)習(xí)的影響。

Fig1 被動回避實驗裝置簡圖

基本原理及設(shè)備

該實驗裝置由一個明亮隔室和一個黑暗隔室組成，兩室之間通過一扇滑動門分隔。實驗基于負(fù)性強化原理：動物在先前因進(jìn)入看似更安全的暗室而受到懲罰后，學(xué)會抑制進(jìn)入該區(qū)域的本能行為。

在習(xí)得階段，滑動門關(guān)閉，將明室與暗室隔開。將嚙齒類動物放入明亮隔室，允許其自由探索這一新環(huán)境一段時間。隨后滑動門開啟，動物可自由進(jìn)入暗室。一旦其完全進(jìn)入暗室，滑動門自動關(guān)閉，并立即給予一次輕微的足底電擊。由此，動物將暗室與厭惡體驗建立關(guān)聯(lián)。

為評估記憶的形成與提取，在習(xí)得階段24小時后進(jìn)行保留測試：動物再次被放回明亮隔室，滑動門保持開啟狀態(tài)，允許其自由選擇是否進(jìn)入曾與電擊關(guān)聯(lián)的暗室。記錄動物進(jìn)入暗室前的潛伏期，該時間越長，表明其情緒性記憶越強。所有行為參數(shù)均通過自動化追蹤系統(tǒng)進(jìn)行記錄和分析。

實驗步驟

實驗開始前，先組裝并清潔明暗箱：用70%乙醇徹底擦拭箱體所有內(nèi)表面，確保隔板門關(guān)閉，并開啟僅照亮明室的頂部光源；同時打開電擊器，預(yù)設(shè)好所需電擊強度。將小鼠輕柔放入明室中央，使其適應(yīng)環(huán)境約60秒，在此期間小鼠可自由探索明室；開啟隔板門前需確認(rèn)小鼠背對門口（角度≥45°）且距離門口至少5 cm以避免因門開啟聲響引發(fā)沖動行為。隨后升起隔板門并立即啟動計時器，記錄從開門到小鼠全身（包括尾巴）進(jìn)入暗室的潛伏期；若小鼠僅部分進(jìn)入后退回，應(yīng)保持門開啟直至其完全穿越。一旦小鼠完全進(jìn)入暗室，立即關(guān)閉隔板門，并在暗室內(nèi)停留設(shè)定時間后施加一次足底電擊；電擊結(jié)束后繼續(xù)讓小鼠在暗室停留30秒以強化環(huán)境-厭惡刺激關(guān)聯(lián)，隨后將其放回飼養(yǎng)籠。

每次測試后須徹底清除尿糞，并用70%乙醇全面清潔箱體以消除氣味干擾。該流程每日進(jìn)行一次，連續(xù)5天；若小鼠在某次訓(xùn)練中于明室停留達(dá)300–600秒仍未進(jìn)入暗室（即達(dá)到學(xué)習(xí)標(biāo)準(zhǔn)），則視為記憶形成成功，手動移出并不再參與后續(xù)測試，其潛伏期記為最大值。整個過程可通過紅外攝像機(jī)記錄，用于自動化或人工分析行為數(shù)據(jù)。

注意事項

電擊時間與強度的設(shè)定：

延遲電擊施加時間（即小鼠進(jìn)入暗室后到給予電擊的間隔）和/或降低電擊強度，可提高實驗對輕度學(xué)習(xí)障礙的敏感性。例如，若預(yù)期存在顯著的海馬功能損傷并導(dǎo)致穿越潛伏期明顯延長，可采用較強電擊（如1.2 mA）和較短延遲（如30秒），以最大化組間差異；而若僅假設(shè)存在輕度海馬功能減弱，則建議使用中等強度電擊（0.4–0.8 mA）和較長延遲（5–10分鐘），以便在后期訓(xùn)練階段檢測到較細(xì)微的潛伏期縮短。

測量與控制方式：

行為數(shù)據(jù)可通過視頻追蹤系統(tǒng)或光束感應(yīng)裝置自動采集。主要測量指標(biāo)包括：各試次中的穿越潛伏期以及描繪各實驗組動物達(dá)標(biāo)比例隨時間變化的生存曲線。由于電擊期間小鼠位于不透明的暗室中，此階段無行為記錄；整個實驗中唯一被評估的行為是從明室進(jìn)入暗室的穿越潛伏期。

環(huán)境與其他影響因素：

為獲得一致、可重復(fù)的結(jié)果，必須嚴(yán)格控制實驗環(huán)境。測試應(yīng)在安靜、光線柔和的房間中進(jìn)行，并盡可能減少聲音、視覺及氣味等外界干擾。將明暗箱置于隔音箱內(nèi)可進(jìn)一步提升穩(wěn)定性。鑒于晝夜節(jié)律已被證實影響學(xué)習(xí)與記憶，建議所有訓(xùn)練和測試在每天固定時間段進(jìn)行。例如，在光照周期開始后2–4小時（評估非活躍期行為）或在黑暗周期開始后2–4小時（評估活躍期行為）。

動物：

在正式實驗前，應(yīng)通過預(yù)實驗明確所用動物品系、設(shè)備和環(huán)境組合下的行為表型。這一點在以下情況尤為重要：使用不同近交系或遠(yuǎn)交系小鼠、小鼠在測試前接受過手術(shù)或行為干預(yù)或需比較幼年小鼠、性別差異等。若涉及基因修飾或藥物處理，還需確認(rèn)這些因素是否影響小鼠對電擊的敏感性或在明暗箱中的自發(fā)行為（如探索、焦慮水平）。建議先進(jìn)行一次5–10分鐘的標(biāo)準(zhǔn)明暗箱測試（無電擊），記錄兩室間的穿梭次數(shù)及在明室停留總時間。此外，部分實驗室傾向于在訓(xùn)練前對小鼠進(jìn)行5–7天的手抓握適應(yīng)并在測試前將其單籠飼養(yǎng)，以減少群居應(yīng)激對行為的干擾。

文獻(xiàn)引用：

• Eagle AL, Wang H, Robison AJ. Sensitive Assessment of Hippocampal Learning Using Temporally Dissociated Passive Avoidance Task. Bio Protoc. 2016 Jun 5;6(11):e1821. doi: 10.21769/BioProtoc.1821. PMID: 29119127; PMCID: PMC5672628.

• Eagle AL, Gajewski PA, Yang M, Kechner ME, Al Masraf BS, Kennedy PJ, Wang H, Mazei-Robison MS, Robison AJ. Experience-dependent induction of hippocampal DeltaFosB controls learning. J Neurosci. 2015;35(40):13773–13783.

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