Cell?|?開發(fā)StealTHY 平臺(tái)以消除 Cas9 免疫原性并實(shí)現(xiàn)真實(shí)體內(nèi) CRISPR 篩選

撰文丨雪月

CRISPR-Cas9 基因篩選作為腫瘤學(xué)中發(fā)現(xiàn)新基因和通路的重要工具，其潛力已被廣泛證實(shí)。然而，大多數(shù)體內(nèi)研究仍依賴于免疫缺陷小鼠，或采用如 Cas9 轉(zhuǎn)基因或敲入鼠等嚴(yán)格控制的模型，以避免 Cas9 引發(fā)的免疫原性反應(yīng)。這種依賴限制了 CRISPR-Cas9 技術(shù)在免疫完整宿主中的更廣泛應(yīng)用。目前，Cas9 免疫原性對(duì) CRISPR 篩選在免疫完整模型中的信息可靠性影響仍不清楚——尤其是在腫瘤轉(zhuǎn)移研究中。考慮到免疫系統(tǒng)與腫瘤相互作用在轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵作用，迫切需要改進(jìn)的臨床前模型，使得能夠在自然免疫壓力下開展體內(nèi) CRISPR 篩選。近年來，人源化造血嵌合小鼠模型在免疫腫瘤學(xué)等領(lǐng)域中逐漸成為有前景的研究工具。然而，CRISPR 篩選在此類人源化腫瘤模型中的應(yīng)用仍未被探索。

近日，來自瑞士聯(lián)邦理工學(xué)院的Nicola Aceto團(tuán)隊(duì)在Cell上發(fā)表題為StealTHY: An immunogen-free CRISPR platform to expose concealed metastasis regulators in immunocompetent models的文章。本研究系統(tǒng)揭示了這一免疫編輯效應(yīng)的機(jī)制，并提出了一種創(chuàng)新性平臺(tái)——StealTHY（Stealth CRISPR），該平臺(tái)通過免疫隱形設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了在免疫完整宿主中的可靠體內(nèi)基因篩選。

作者團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了StealTHY 平臺(tái)。該系統(tǒng)在設(shè)計(jì)上完全避免持續(xù)性 Cas9 表達(dá)，采用短暫遞送的Cas9蛋白（Apo-Cas9）實(shí)現(xiàn)“hit-and-run”式基因編輯，并結(jié)合小鼠自體Thy1報(bào)告基因及“hara-kiri”自切除載體。Cas9在48小時(shí)內(nèi)即被清除，而基因敲除效果得以保留。實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng) StealTHY 編輯的腫瘤細(xì)胞在免疫完整宿主中可穩(wěn)定生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移，無免疫排斥或克隆丟失現(xiàn)象，其轉(zhuǎn)錄譜與未經(jīng)編輯細(xì)胞高度相似，證明其免疫隱形特性。

利用 StealTHY 平臺(tái)，研究者在三種乳腺癌模型（4T1、MVT1、Py2T）中進(jìn)行了體內(nèi)配體–受體信號(hào)通路篩選，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)此前被傳統(tǒng) CRISPR 篩選掩蓋的轉(zhuǎn)移調(diào)控基因，包括受體酪氨酸激酶家族（Erbb2/3、Egfr、Axl）和 TGF-β 信號(hào)通路成員（Tgfbr2、Gdf9、Amhr2）等。其中，Amhr2在轉(zhuǎn)移灶中顯著耗竭（約20倍），提示其在促進(jìn)癌癥遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中具有關(guān)鍵作用。相反，Tgfbr2 的敲除促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，驗(yàn)證其抑癌功能。驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，Erbb2/3 或 Egfr 敲除能顯著抑制乳腺癌的自發(fā)轉(zhuǎn)移，而 Amhr2 敲除則顯著延長(zhǎng)動(dòng)物生存期并降低循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量。

在人源化免疫小鼠模型（huNSG）中，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn) Cas9 同樣誘導(dǎo)人源 T 細(xì)胞的免疫清除，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移顯著減少，而 StealTHY 平臺(tái)可成功避免這一現(xiàn)象，恢復(fù)自然的腫瘤–免疫互作。進(jìn)一步利用人源化 StealTHY 系統(tǒng)進(jìn)行體內(nèi)篩選，發(fā)現(xiàn)與小鼠模型一致的信號(hào)通路富集模式，其中AMH–AMHR2 軸在轉(zhuǎn)移灶中被顯著耗竭，提示其跨物種的保守促轉(zhuǎn)移作用。隨后對(duì) TCGA 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示 AMH 高表達(dá)與乳腺癌、肺腺癌和結(jié)腸癌的不良預(yù)后顯著相關(guān)，而 GDF9 高表達(dá)與良好生存相關(guān)。該發(fā)現(xiàn)揭示了 AMH–AMHR2 通路在多癌種中的臨床可操作性，為靶向轉(zhuǎn)移治療提供了新的方向。

本研究中的StealTHY 平臺(tái)通過消除 Cas9 免疫原性，實(shí)現(xiàn)了在免疫完整和人源化模型中的真實(shí)體內(nèi) CRISPR 篩選，揭示了此前被隱藏的轉(zhuǎn)移驅(qū)動(dòng)基因，并確定了AMH–AMHR2 軸這一可靶向的臨床相關(guān)信號(hào)通路，為轉(zhuǎn)化性腫瘤研究和免疫-基因交互機(jī)制探索提供了新的實(shí)驗(yàn)框架。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.10.007

制版人： 十一

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