《食品科學(xué)》：集美大學(xué)曹敏杰教授等：鮑源ACE/ACE2雙靶點活性肽的分離及其活性分析

高血壓是全球主要公共健康問題。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）和其同源酶ACE2在腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)中發(fā)揮不同作用，共同調(diào)控血壓。ACE可催化血管緊張素（Ang）I轉(zhuǎn)化為具有強縮血管作用的Ang II，促進(jìn)血管收縮、交感興奮和醛固酮的釋放，使血壓升高；而ACE2則將Ang II水解生成Ang-(1-7)，具有血管舒張和抗增殖作用。高血壓患者常因ACE與ACE2的失衡導(dǎo)致Ang II積累和Ang-(1-7)減少，加劇血管損傷及器官纖維化。因此，抑制ACE活性和增強ACE2活性為開發(fā)抗高血壓治療提供了重要策略。

近年來研究表明，鮑魚蛋白經(jīng)酶解后可釋放出具有特定生物功能的肽段，其中部分肽具有ACE抑制活性，對調(diào)節(jié)血壓具有潛在作用。此外，鮑魚富含的牛磺酸亦被證實具備降血壓和心血管保護效應(yīng)。

集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院的李萌、張捷凱、曹敏杰*等實驗擬以福建高產(chǎn)鮑魚為原料，旨在制備具ACE抑制與ACE2上調(diào)活性的雙靶點降壓肽，發(fā)掘其在血壓調(diào)控中的應(yīng)用潛力，以期為開發(fā)安全高效的海洋功能性降壓肽提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 鮑魚酶解液的制備

酶解法已成為制備食源性生物活性肽的常用技術(shù)，具有效率高、可擴展性強等優(yōu)點，但其效果高度依賴水解條件的優(yōu)化。本研究選用5 種商業(yè)蛋白酶對鮑魚肌肉進(jìn)行酶解，發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的ACE抑制率最高，為（80.05±0.54）%，木瓜蛋白酶產(chǎn)物在ACE2上調(diào)方面表現(xiàn)突出（圖1A）。綜合兩者活性，選用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。由圖1B、C可知，隨著木瓜蛋白酶添加量增加與酶解時間的延長，ACE抑制率逐漸升高，最終趨于穩(wěn)定。可能是高分子質(zhì)量肽的減少或反應(yīng)達(dá)到平衡導(dǎo)致水解反應(yīng)速率趨于穩(wěn)定。結(jié)合ACE2上調(diào)活性，確定加酶量為0.6%，酶解時間120 min。為提高酶解效率進(jìn)行二次酶解，以最大化水解鮑魚肌肉蛋白。由圖1D可知，隨著中性蛋白酶添加量的增加，酶解效果逐漸增強。但是，添加量過高時，活性肽可能過度水解，導(dǎo)致ACE2活性下降。最終結(jié)合ACE和ACE2活性，確定二次酶解最適條件為加酶量0.6%、酶解時間2.5 h（圖1E），通過2 次酶解獲得鮑魚肽酶解液。

2 鮑魚ACE/ACE2雙靶點降壓肽的分離純化

將酶解液經(jīng)3 kDa超濾膜分離為＜3 kDa與＞3 kDa兩大組分，凍干復(fù)溶后測定其ACE抑制活性及ACE2上調(diào)活性。圖2A顯示，＜3 kDa組分的IC50為1.36 mg/mL，顯著低于＞3 kDa組分的2.59 mg/mL，表明其ACE抑制活性更強，可能因后者含未完全酶解的大分子肽，難以進(jìn)入ACE活性位點。如圖2B所示，＞3 kDa組分對ACE2上調(diào)效果更明顯，但小分子肽更易被腸道吸收。因此，＜3 kDa的組分因其較強的ACE抑制活性和吸收特性，進(jìn)行后續(xù)研究。

將＜3 kDa組分經(jīng)SuperdexTM peptide 10/300 GL凝膠柱分離，獲得F1和F2兩個組分（圖2C）。對兩個組分凍干復(fù)溶后測定其活性，F(xiàn)1的IC50為0.74 mg/mL，明顯優(yōu)于F2的3.45 mg/mL。ACE2活性測定結(jié)果如圖2D所示，其活性隨F1質(zhì)量濃度增加表現(xiàn)出良好上調(diào)趨勢。基于其優(yōu)異活性，選取F1進(jìn)行進(jìn)一步純化。F1凍干后復(fù)溶，通過TSK gel G2000 SWXL柱分析分子質(zhì)量分布（圖2E、表1），結(jié)果顯示其中99.99%成分低于3 000 Da，且＜1 000 Da占比達(dá)96.63%。

將F1組分凍干后復(fù)溶至質(zhì)量濃度為10 mg/mL，過0.22 μm濾膜后上樣于ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm）色譜柱，共獲得17 個組分，分別標(biāo)記為a～q（圖3A）。各組分凍干復(fù)溶后測定其ACE抑制及ACE2上調(diào)活性。ACE抑制結(jié)果顯示：c＝f＞d＝h＝i＞a＝j(luò)（圖3B）；ACE2上調(diào)效果為：f＞l＞q＞對照（F1組分）（圖3C）。基于上述結(jié)果，選擇組分f進(jìn)行

De novo

測序分析。

3 氨基酸序列鑒定

組分f經(jīng)鑒定獲得26 個鮑魚來源的肽段，長度為7～12 個氨基酸（表2）。考慮到體內(nèi)消化酶會將活性肽降解為更小片段，需評估這些肽經(jīng)胃腸道消化后產(chǎn)物的活性。利用BIOPEP數(shù)據(jù)庫模擬胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的胃腸消化，得到的肽段及這些消化產(chǎn)物對ACE抑制作用的結(jié)果是否已有報道列于表2。

4 分子對接

根據(jù)BIOPEP預(yù)測結(jié)果，對消化后尚未被報道的多肽進(jìn)行分子對接模擬，以篩選潛在ACE抑制肽。結(jié)合自由能作為篩選依據(jù)，結(jié)合能越低表明結(jié)合越穩(wěn)定。對接結(jié)果（表3）顯示，AGF、ATK、PIITK、AK、PVGR和PW與ACE的結(jié)合自由能較低，因此選擇這6 個肽段進(jìn)行固相合成。

研究發(fā)現(xiàn)，ACE的活性依賴于3 個關(guān)鍵位點：S1、S2和S1’，分別包含氨基酸殘基ALA354、GLU384、TYR523（S1），GLN281、HIS353、LYS511、HIS513、TYR520（S2）及GLU162（S1’）。其中，鋅離子在催化中心由GLU411、HIS387和HIS383配位，是其酶活性的核心。ACE抑制肽可通過與這些殘基的多種非共價作用（如氫鍵、鹽橋、疏水作用等）結(jié)合，干擾其催化結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)抑制作用。

如圖4A所示，PIITK可與ACE活性位點多處殘基作用：與S1口袋中的HIS383和HIS353形成氫鍵，并與S1’口袋中的GLU162以及周圍氨基酸ASP453、GLU376、ASP377通過鹽橋相互作用。此外，PIITK與S1口袋中的TYR523，S2口袋中的HIS353、HIS513以及周圍氨基酸TRP279、HIS383通過烷基與π-烷基相互作用，顯著增強與ACE的結(jié)合穩(wěn)定性。

如圖4B所示，PVGR可通過氫鍵與S1口袋的ALA354、GLU384以及S2口袋的GLN281、LYS511結(jié)合，并與GLU384、ASP453、GLU376等形成鹽橋。其中，GLU384是鋅離子結(jié)合的關(guān)鍵殘基，對增強抑制效果具有重要意義。此外，PVGR還可與鋅四面體配位結(jié)構(gòu)中的殘基產(chǎn)生疏水作用，進(jìn)一步破壞其穩(wěn)定性，從而抑制ACE的活性。

因此，PIITK和PVGR等降壓肽通過氫鍵、鹽橋及疏水作用與ACE活性口袋關(guān)鍵殘基結(jié)合，顯著提升與ACE的結(jié)合穩(wěn)定性，并可能通過影響其結(jié)構(gòu)和催化中心從而增強其抑制作用。

5 合成肽的體外功能活性

根據(jù)分子對接結(jié)果，選擇AGF、ATK、PIITK、AK、PVGR和PW 6 種多肽進(jìn)行固相合成。經(jīng)質(zhì)譜鑒定與純度分析，6 種肽純度均超過95%。

測定了6 種合成肽在終濃度為1.0 mmol/L時的ACE抑制率（圖5A），其中PIITK和PVGR抑制率均超50%，其余肽低于50%。進(jìn)一步測定IC50值，PIITK為0.854 mmol/L（95%置信區(qū)間（CI）：0.791～0.922），PVGR為0.771 mmol/L（95% CI：0.702～0.842）（圖5C、D），表明兩者具備調(diào)節(jié)血壓的潛力。此外，在1.0 mmol/L條件下，PW對ACE2上調(diào)作用最顯著，其次為PVGR、AK與ATK；PIITK無顯著上調(diào)作用，AGF則抑制ACE2活性（圖5B）。綜合分析，選定PIITK和PVGR進(jìn)行后續(xù)研究。

6 抑制動力學(xué)分析

采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法分析不同濃度PIITK對ACE的抑制模式（圖6A）。結(jié)果顯示，隨PIITK濃度升高，ACE的最大反應(yīng)速度（

V

max ）和米氏常數(shù)（

K

m ）均呈現(xiàn)減小趨勢，擬合曲線在第二象限交匯，表明其為混合競爭性抑制模式。即PIITK通過結(jié)合ACE活性位點，同時影響酶的催化效率與底物親和力，從而抑制酶活性。這與鯖魚肌肉蛋白來源的PLITT的抑制模式一致。類似的，來自刺參的SAAVGSP以及從雞胸肉中獲得的KPLL和KPL也表現(xiàn)出混合性抑制作用。

如圖6B所示，PVGR在不同濃度下擬合曲線交于Y軸正半軸，ACE的

V

max 保持恒定，而

K

m 逐漸增大，表明其為典型競爭性抑制劑。PVGR通過與底物競爭ACE活性位點結(jié)合，阻礙底物進(jìn)入酶的催化中心，抑制其反應(yīng)效率。這與石莼來源的ACE抑制肽KAF的抑制類型相符。大多數(shù)ACE抑制肽，包括降壓藥物卡托普利、依那普利和賴若普利，均通過競爭性抑制與ACE結(jié)合。

7 動力學(xué)模擬

分子動力學(xué)模擬可揭示多肽-ACE復(fù)合物的構(gòu)象變化與穩(wěn)定性。均方根偏差（RMSD）衡量構(gòu)象穩(wěn)定性，值越小說明結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。因此，本研究通過RMSD評估體系穩(wěn)定性（圖7A），PIITK-ACE體系在80 ns后趨于穩(wěn)定，RMSD波動約3.3 ?；PVGR-ACE體系在40 ns后趨于平衡，RMSD約為2.5 ?，表明其結(jié)合更穩(wěn)定。此外，兩個體系的回轉(zhuǎn)半徑（

R

g ）與溶劑可及表面積（SASA）呈輕微波動（圖7B、C），提示復(fù)合物存在一定構(gòu)象調(diào)整。

均方根漲落（RMSF）是衡量蛋白質(zhì)中氨基酸殘基柔性的常用指標(biāo)。如圖7D所示，兩體系大部分殘基RMSF低于3 ?，說明體系柔性低、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

氫鍵作為配體與蛋白質(zhì)結(jié)合的重要作用力，能夠穩(wěn)定復(fù)合物結(jié)構(gòu)。氫鍵分析表明，PIITK-ACE與PVGRACE在動力學(xué)過程中形成0～6 個氫鍵，平均保持3 個左右（圖7E），顯示兩者與ACE具有良好的結(jié)合力。

自由能景觀（FEL）可視化蛋白-配體相互作用的穩(wěn)定狀態(tài)，能量團簇越集中越穩(wěn)定。FEL分析進(jìn)一步揭示了蛋白-肽復(fù)合物的能量狀態(tài)（圖7F、G）。PVGR-ACE復(fù)合物呈現(xiàn)更深且集中的能量谷，能量屏障更高，代表其結(jié)合構(gòu)象更穩(wěn)定。

綜上，PIITK-ACE和PVGR-ACE復(fù)合物均展現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性與結(jié)合親和力，特別是PVGR-ACE體系，其更低的RMSD值、更強的氫鍵作用及更穩(wěn)定的自由能分布，這為其作為降壓肽的潛力提供了有力的理論支持。

在多肽結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系研究中，氨基酸組成、鏈長及結(jié)構(gòu)特征對ACE抑制與ACE2激活活性具有重要影響。疏水性殘基（如PRO、VAL、PHE）有助于嵌入ACE的S1/S2口袋形成疏水相互作用，正電荷殘基（如ARG、LYS）則有利于與ACE2表面負(fù)電區(qū)域結(jié)合，從而提升活性。其次，肽段長度在4～8 個氨基酸范圍內(nèi)可兼顧口袋識別和胃腸道穩(wěn)定性，過短的二肽或三肽難以完全覆蓋活性位點，過長的肽則易被蛋白酶降解。本研究篩選獲得的PVGR和PIITK均符合這一規(guī)律。PVGR中的PRO與VAL增強與ACE的疏水相互作用，ARG殘基則通過靜電作用增強對ACE或ACE2的結(jié)合，短鏈結(jié)構(gòu)兼具口袋覆蓋與柔性穩(wěn)定性。PIITK中的雙ILE構(gòu)建疏水核心，THR羥基與LYS末端通過氫鍵和離子鍵增強與ACE關(guān)鍵殘基GLU411、HIS387和HIS383的結(jié)合，維持構(gòu)象穩(wěn)定并抵抗酶解。分子對接和動力學(xué)模擬顯示，PVGR-ACE體系的RMSD更低、氫鍵更豐富，而PIITK-ACE復(fù)合物在關(guān)鍵殘基處保持高度剛性，分別解釋了兩者不同的抑制模式。構(gòu)效關(guān)系揭示了兩種肽產(chǎn)生活性的機制，為鮑魚降壓肽的序列優(yōu)化與功能開發(fā)提供理論支持。

結(jié)論

ACE與ACE2在血壓調(diào)控中具有協(xié)同作用，但傳統(tǒng)降壓肽篩選大多聚焦于ACE。本研究引入ACE2上調(diào)活性作為輔助篩選指標(biāo)，建立雙重篩選體系。以鮑魚肌肉為原料，經(jīng)分步酶解、超濾、凝膠過濾層析及RP-HPLC純化后，獲得26 條鮑魚源降壓肽。分子對接結(jié)果顯示AGF、ATK、PIITK、AK、PVGR和PW與ACE結(jié)合自由能較低。ACE抑制實驗中，PIITK與PVGR的IC50分別為0.854 mmol/L和0.771 mmol/L，ACE2調(diào)控中PW上調(diào)作用最顯著，其次為PVGR、AK和ATK。分子動力學(xué)分析顯示，PIITK-ACE與PVGR-ACE復(fù)合物均穩(wěn)定，PVGRACE體系RMSD更低、氫鍵更豐富，表明其結(jié)合更緊密。本研究在肽段篩選與體外驗證方面取得進(jìn)展，但仍缺乏動物學(xué)實驗及穩(wěn)定性評估。未來應(yīng)完善動物學(xué)實驗，優(yōu)化酶解工藝以提升產(chǎn)率、降低成本，為實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

作者簡介

通信作者：

曹敏杰 教授

享受國務(wù)院政府特殊津貼專家，中國水產(chǎn)學(xué)會水產(chǎn)品加工與綜合利用分會副主任委員。長期從事水產(chǎn)品加工及副產(chǎn)物高值化利用、食品生物技術(shù)等方向研究工作。先后主持國家自然科學(xué)基金、“藍(lán)色糧倉”國家重點研發(fā)計劃項目課題等國家級、省部級科研項目50余項，在國內(nèi)外學(xué)術(shù)刊物發(fā)表論文240余篇。獲福建省科技進(jìn)步獎3項，自然科學(xué)獎2 項，以第一發(fā)明人獲國家授權(quán)發(fā)明專利15 件。擔(dān)任《Food Science and Human Wellness》《Journal of Ocean University of China》《水產(chǎn)學(xué)報》《食品科學(xué)》《食品工業(yè)科技》等刊物編委。

第一作者：

李萌 碩士研究生

李萌，女，碩士研究生就讀于集美大學(xué)，研究方向為水產(chǎn)品加工及貯藏工程。

本文《鮑源ACE/ACE2雙靶點活性肽的分離及其活性分析》來源于《食品科學(xué)》2025年46卷第19期124-133頁，作者：李萌，張捷凱，何弼璐，翁凌，張凌晶，孫樂常，曹敏杰*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250402-019。點擊下方 閱讀原文 即可查看文章相關(guān)信息。

實習(xí)編輯：劉芯；責(zé)任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)