病毒特輯，單純皰疹病毒篇

單純皰疹病毒是人類最常見的病毒之一，含有8種亞型，90%以上的人群至少感染其中一種單純皰癥病毒。總結皰疹病毒學知識以形成自己的思路是很有必要的。因為是科學性總結，所以不會像文學作品或者小說那樣富有情節。但是我們會采用小說的寫作手法，力爭在尊重科學事實的基礎上做到嚴謹、有料、有味。為做到簡潔，不再插入文獻。不做特別說明的話，這里的病毒是指Ⅰ型人類單純皰疹病毒（HSV-1）。內容以李琦涵、姜莉編著的《人類皰疹病毒的病原生物學》綠皮書為依據，參考著名病毒學家Bernard Roizman、David M. Knipe等主編的《費氏病毒學》，舒紅兵教授主編的《抗病毒天然免疫》。

好了，開始！

第一章 病毒入侵

事實上，病毒入侵是一個復合的概念。既可以是機體水平上（我們通常稱作感染），也可以是細胞水平。不過，通常意義上的病毒入侵是指病毒顆粒進入細胞的過程。下面，我們對兩個過程都做介紹。仔細想想，其實這兩個過程并不矛盾，因為病毒入侵是先要通過機體的防線，再進入易感性細胞并最終完成其復制周期。

呼吸道、消化道和泌尿生殖道粘膜以及體表的皮膚構成機體防止病毒入侵的物理屏障。同時，生物體還可以分泌能夠抵抗病毒感染的小分子多肽，如防御素（defensin）、溶菌酶（lysozyme）、導管素（cathelicidin）等組成機體防御的化學屏障。宿主對病毒的免疫反應是天然免疫的第三道屏障。這些屏障共同組成機體抵抗病毒入侵的第一道防線。但是，病毒很狡猾，可以突破這些屏障，從而進入機體。

皰疹病毒是一類以潛伏感染而著稱的病毒。它們有著自己的生存周期，從生到死，跟人類是一樣一樣滴。在病毒的復制周期中，病毒通過細胞膜進入細胞是非常關鍵的一個環節，因為沒有入侵就沒有后面的故事。現在，咱們就詳細說說病毒通過細胞膜進入細胞的全過程吧。相對于人體細胞而言，病毒很小很小，基本上是乒乓球或玻璃球與籃球的關系。

皰疹病毒顆粒的整體直徑為170~200nm（平均直徑185nm，加上棘突會增至225nm），而在人體細胞中，卵細胞平均直徑200μm，神經細胞為100um（長度可達0.7~1m），紅細胞為7um，白細胞為3~4um。因此，從體積的角度看，病毒顆粒與宿主細胞可以看成乒乓球和籃球，也就是說，對病毒來說，細胞是個龐然大物。那么，病毒是怎樣進入細胞這個“龐然大物”的呢？簡單地說，這是由病毒囊膜蛋白及其定位于細胞表面的受體決定的。

如前所述，人體的所有細胞（器）表面都存在很多分子。免疫細胞（器）的表面分子能夠識別病原相關分子模式（PAMP），通常被稱為模式識別受體（PRR），可以特異性地識別“危險信號”，啟動機體的免疫應答。一般情況下，非免疫細胞不參與免疫應答。事實上，在長期的進化中，病毒正是利用這些表面分子入侵宿主細胞的。

在病毒學中，能夠直接與天然病毒粒子結合的細胞表面分子通常被稱為病毒受體（viral receptor）；能夠通過其他分子間接與天然病毒粒子或與第一步結合后已發生構象改變的病毒粒子結合的細胞分子稱為共受體（coreceptor）。共受體可以是細胞表面分子，也可以是游離的細胞分子。病毒受體和共受體是病毒嗜性（viral tropism）的主要因素，是病毒感染早期的關鍵步驟，也決定病毒能否入侵細胞，因為病毒不能通過細胞脂質雙分子層直接進入細胞。

讀到這里，很多人肯定會產生困惑：宿主細胞可對入侵的病毒產生免疫應答，同時，病毒又能通過受體和共受體進入細胞，這難道不是悖論嗎？當然不是，因為發揮免疫應答的是免疫細胞，而病毒入侵的細胞大多是非免疫細胞，這兩類細胞的表面分子是不一樣的。類似的情況是外敵（病毒）入侵時，普通老百姓（非免疫細胞）和軍隊（免疫細胞）的反應是不一樣的，因為老百姓沒有防御能力，而軍隊是配有武器的，是可以直接反擊的。為了方便理解和情節的敘述，咱們先從宿主細胞的免疫應答開始吧！

在所有的信號通路中，目前研究最為透徹的是TLRs。TLR在免疫細胞中均高水平表達，而在非免疫細胞中表達較少。迄今已經報道的人類TLR家族成員有11種，且均為跨膜蛋白。TLR分子在細胞內的分布有所不同，其中TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10定位于細胞膜，而TLR3、TLR7、 TLR8和TLR9定位于細胞內體膜上。不過，在抗HSV-1感染中，主要是TLR2、TLR3和TLR9參與識別和抵御，而且整合素或許在其中發揮調節作用。

另外，盡管HSV-1病毒是dsDNA病毒，其復制周期中也會產生dsRNA，后者進一步激活RLR信號通路，即RIG-I和MDA5信號通路。同時，病毒入侵引起的危險信號也會激活NLR信號通路，但是關于HSV-1感染與NLR信號通路的研究還比較少。關于HSV-1與天然免疫其他識別受體關系的研究則主要集中在DNA受體家族上，而不是C型凝集素受體家族或其他固有免疫特異性PRRs。HSV-1是dsDNA病毒，因而研究DNA受體的意義要比其他識別受體意義深遠。

然而，這一切并不是病毒的本意，它們并不是要激活機體的天然免疫系統，而是要入侵人體的細胞并建立潛伏感染和再激活的裂解性感染，從而把自身的基因組DNA傳遞下去。因而，在機體免疫系統激活的同時，有些病毒微粒則逃過宿主的攻擊，在機體粘膜或體表的表皮細胞完成裂解性感染，其中又有一些沿著末梢神經并上行至機體的三叉神經節和背根神經節等神經中“潛伏”下來。然而，無論是表皮細胞還是神經細胞，它們自身的防御能力是極其有限的。病毒恰恰是利用這些非免疫細胞的低防御的弱點入侵細胞的。那么，具體入侵過程是怎樣的呢？病毒受體和輔助受體！

基于現有的研究資料，我們可以根據皰疹病毒感染所引起的病理形式大體將其分為兩類，即溶胞性感染和潛伏性感染：前者主要是皰疹病毒針對上皮細胞、成纖維細胞等所產生的感染形式；而后者則多見于神經細胞和淋巴細胞的感染。為什么皰疹病毒可以在同樣的機體環境中導致這樣兩種截然不同的感染形式，到目前為止尚無完善的解釋。

通常情況下，病毒是以液晶態的形式存在的，而不是細胞似的固態。最初的相互作用是靜電引力吸引，這一階段可逆、不穩定。隨后，病毒能夠借助其表面的囊膜蛋白與細胞受體識別結合（粘附），然后通過膜融合（病毒囊膜與細胞膜都是雙層脂膜）入侵宿主細胞。這一過程，相對穩定、不可逆。

對HSV-1病毒吸附宿主細胞膜表面受體的研究表明，HSV在進入細胞的過程中，要通過膜蛋白和多個細胞受體、輔助受體的結合，才能完成其介導病毒囊膜與細胞膜融合并使病毒進入細胞的任務 。這樣的功能要求，使得病毒糖蛋白的多種糖蛋白分子必須綜合發揮互補作用。對此，現有的模型認為，HSV在吸附細胞膜表面時，首先是糖蛋白gC和/或gB與細胞表面的硫酸乙酰肝素黏蛋白（HSPG）非特異性結合，這種結合使得病毒囊膜與細胞膜的空間距離縮短。隨后，gD則與胞膜上的特異性受體結合，后者可能為HVEM（Herpes virus entry mediator，腫瘤壞死因子家族成員），或是nectin-1和nectin2（免疫球蛋白超家族成員），還可能是由3-O-磺基轉移酶催化硫酸肝素黏分子而產生的異構體（3-OST-3）。這些結合進一步啟動gH、gL ，可能還有gK等，與上述蛋白一起，發揮促進介導病毒囊膜與細胞膜融合的作用。在此過程中，還可能形成脂代結構的（膽固醇和鞘磷脂分子富集而形成特定的微結構域），實際上可以使膜內的相應受體蛋白發生動力學變化，以促進囊膜與胞膜的融合。同時，還可能引發某些特定的胞膜信號受體分子的結構運動，從而向細胞內導入某些信號。

下面我們就以“Specific Association of Glycoprotein B with Lipid Rafts during Herpes Simplex Virus Entry”為例，探討病毒糖蛋白gB在病毒入侵細胞的具體作用。（在入侵過程中，宿主細胞中信號通路的激活以及其他囊膜蛋白的功能不是我們這里討論的重點。）

Bender 等人發現用膽固醇或脂類螯合劑處理細胞后，病毒感染細胞的能力明顯下降；再加膽固醇做Rescue實驗時，病毒的感染能力又恢復到正常水平。但是，病毒感染之后，再用膽固醇或脂類螯合劑處理細胞時，病毒的復制并不受影響。因此，他們推斷，細胞表面的脂類和膽固醇分子與病毒入侵密切相關，但是與病毒的復制無關。我們已經知道，病毒通過糖蛋白與細胞特定的受體識別、結合進入細胞，那么病毒的糖蛋白與膽固醇或脂類有什么樣的關系呢？他們用梯度離心法獲得脂類密集區域（即脂滴）可能含有或結合的病毒蛋白或細胞蛋白，然后用WB檢測。實驗發現，脂滴中并不含有病毒蛋白受體HVEM和nectin-1，但是他們檢測到了病毒蛋白gB。因此，他們推斷，gB與脂滴中的某種成分（或許是受體）相互作用，從而介導病毒入侵宿主細胞。這樣，我們也就更加接近真理。后來，Bender等人獲得了gB的晶體結構，并在Science上發表文章。當然，這些都是后話。那么，結合教材和文獻，我們可以推斷病毒入侵宿主細胞的大致過程：

人物：四處游蕩（布朗運動）的屌絲（病毒分子），朝九晚五的女白領（細胞）。

場景：屌絲走路從來不看路，一不小心，屌絲撞到了下班趕公交的女白領（女白領的車鑰匙忘記帶了所以只得擠公交；不過，今天工作進展順利，雖是擠公交，她也很高興，以致被屌絲撞了一下還能還以微笑）屌絲愛上了女白領，狂追不舍，并最終以身相許。

情節：病毒蛋白通過靜電作用與宿主細胞在空間上接近，隨后，病毒通過其囊膜蛋白gB和gC與細胞表面的硫酸肝素糖分子非特異性結合。但是，這種結合并不穩定。緊接著，病毒發生構象調整，并通過gD與其受體HVEM（或者是nectin-1，亦或是3-OST-3)結合，此時的結合是特異性結合，結合牢固。這樣，粘附（Attachment）任務就完成了。接下來，gB與脂筏上的特定受體結合并觸發囊膜-細胞膜融合事件，同時，gH/gL異源二聚體被招募到融合起始處，gE、gG、gK、gJ也相繼加入。所有的病毒蛋白相互合作，協同完成病毒的入侵（Entry)。隨后，病毒脫掉囊膜，皮層蛋白、核衣殼及其包裹的核酸進入宿主細胞，即產生一個跟HSV-1入侵免疫細胞截然不同的結果。

第二章 高速公路

在上一節中，我們重點闡釋了HSV-1通過細胞表面的硫酸乙酰肝素黏蛋白（HSPG）、HVEM、免疫球蛋白超家族成員（nectin1和nectin2）進入細胞的過程，而沒有展開整聯蛋白在其中的重要作用。研究證明，HSV-1、HCMV及HHV-8等整聯蛋白均可以通過細胞表面的整聯蛋白進入細胞。整聯蛋白及其偶聯蛋白FAK、GRAF、Rho-A等激活，常常可以引起細胞內微管動力系統的功能變化。

真核細胞的骨架系統是由一大類纖維蛋白分子以不同形式組成的，其中包括肌動蛋白系統（MF）、微管系統（MT）和中間纖維系統（IF）。這些微管蛋白形成的骨架系統，一方面保證了細胞的特定結構和特定運動形式，另一方面也為細胞質內的各種生化事件提供了相應的網絡骨架和區域，保證各種功能穩定有序進行；同時，這種結構也限制了某些大分子復合物（其大小范圍在分子量500kDa和直徑50nm以內）在細胞內的運動。病毒沒有獨自的細胞結構，必須借助宿主細胞的轉錄翻譯系統，因此，病毒的遺傳物質——dsDNA必定進入細胞核。顯然，像皰疹病毒這種大分子復合物，當其從細胞膜移向其增殖復制區域——細胞核時，必定會受到胞內骨架結構的限制。病毒對此限制做出的反應，則是利用細胞內的大分子運輸機理和自身的結構特點將其遺傳物質移至核內。在此過程中，病毒蛋白自然會不可避免地與細胞的MF、MT和IF發生相應的作用。

事實上，對許多病毒的研究也確實提供了明確的證據。這些病毒既包括桿狀病毒、痘苗病毒、SV40、腺病毒、HIV等，也包括皰疹病毒的多個成員，都能在進入細胞后以各種方式通過與MT、MF網絡系統的相互作用以完成自身在細胞內的移動。實驗表明，多聚纖維蛋白分子抑制劑可以阻斷病毒在細胞內的運輸作業，這充分證實病毒與此類蛋白的作用是病毒感染過程中的重要環節。【綠皮書 李琦涵】

我們以HSV-1為例講述這方面的研究進展。

HSV-1的皮層蛋白VP22能夠誘導MT的聚集，并通過其UL34基因編碼的蛋白與細胞質內的動力蛋白的中間鏈發生相互作用。目前，HSV-1衣殼體借助微管蛋白系統向核內移動的前導事件還不清楚，但是電鏡技術的連續觀察分析顯示，HSV-1在細胞核內向細胞核區域移動的過程的確與微管蛋白系統密切相關。首先，進入細胞的HSV-1衣殼體與微管的相關動力蛋白相結合；隨后，衣殼體則沿著微管網絡移向細胞核；在達到核膜時，HSV-1衣殼體則似乎是將所含的基因DNA注入細胞核內。

當然，形態學的觀察還不能提供完全準確的結果。研究發現，當HSV-1衣殼體進入神經細胞后，細胞動力蛋白的亞基DHC、DIC和動力蛋白激活蛋白的亞基p150均聚集在衣殼體周圍。此時，當使用動力蛋白抑制劑EHNA（erythro-9-3-[2-hydroxynonyl]adenine）處理細胞時，則可以明顯阻斷病毒在神經細胞中的感染。同時，其他實驗還表明，當在細胞內過表達一種能破壞動力蛋白激活蛋白復合體的分子，同時也是動力蛋白激活蛋白亞基的dynamitin時，則使得HSV-1在細胞質內沿微管移動的速度和效率都大大降低。進一步的實驗表明，與病毒衣殼體結合的細胞動力蛋白亞基DHC頭部的結構域，可經ATP水解而產生構象變化，使其自身及與其結合的病毒衣殼體移向微管的負電荷端。此過程同時得到其他動力蛋白亞基DIC、DLIC和DLC的支撐作用。這一過程又得到動力蛋白激活蛋白的啟動作用。這些資料均證明，HSV-1通過與微管及其相關蛋白的結合而獲得趨向細胞核運動的動力，以實現自身到達細胞核的過程。【綠皮書 p158】

事實上，與微管結合、參與病毒移動的病毒蛋白均是由γ基因編碼的衣殼蛋白，而與皮層蛋白和囊膜蛋白沒有明顯的關系。早期研究認為UL34編碼的衣殼蛋白可能是與微管蛋白結合的主要分子，該實驗發現，HSV-1進入細胞后，UL34蛋白會出現構象變化，并與UL31和ICP5相互作用而暴露于衣殼體表面。這些蛋白同時與微管蛋白相互作用，從而保證病毒移向細胞核區域。但是酵母雜交實驗發現，UL35編碼的VP26蛋白與動力蛋白輕鏈RP3和Tctex1之間的相互作用關系，進一步的結合實驗和熒光分析也驗證這一點。盡管其他衣殼蛋白如VP5、VP11/12也可能參與該過程，但是VP26仍發揮主要作用。雖然上述研究均提供詳實的資料，但是對此機理的具體過程尚無定論。病毒沿著高速公路移動的過程看似簡單，但是實際上極其復雜，還有待于更加深入的研究。包括UL34和VP5在內的衣殼蛋白在該過程中的作用也有待確認。

同時，從對病毒結構的初步分析中我們已經知道，皰疹病毒的結構組成包括幾乎各部分，即基因組DNA、核衣殼、皮層蛋白和外膜。核衣殼是病毒毒粒結構的主要框架，它通常由10~20種蛋白組成（依據不同病毒而定），其中既有結構蛋白，也有與病毒DNA裝載、核衣殼的形成相關的功能蛋白。核衣殼的外側為皮層蛋白，它們占據了病毒囊膜包裹空間的1/3。這些皮層蛋白組成一種類似網狀、沒有明顯分布規律的結構，具有重要的生物學功能和結構學意義（如VP16、UL41、UL37）。而最外層的囊膜則是一層來自宿主細胞質體膜的結構，但其上具有多種病毒糖蛋白(從gB到gN，沒有gA和gF)，在病毒吸附細胞受體，進入細胞中發揮重要作用（咱們前面已經說過）。病毒在進入細胞時，棘突和囊膜會參與膜融合而被滯留在細胞膜上，因此實際上進入細胞的病毒成分是部分皮層蛋白、核衣殼及其包裹的基因組。

接下來，我們結合文獻“Ultrastructural Visualization of IndividualTegument Protein Dissociation during Entry of Herpes Simplex Virus 1 into Humanand Rat Dorsal Root Ganglion Neurons”重點說一下皮層蛋白（核衣殼咱們放到后面說）在病毒移向細胞核過程的作用。

Anupriya等人采用廣角反褶積顯微鏡和透射免疫電子顯微鏡這兩種技術觀察皮層蛋白VP16、VP22、UL36和UL37在病毒向細胞核移動過程中的角色。他們用標記熒光蛋白的病毒（比如把YFP連在VP16的N末端），那么病毒表達的VP16就帶上了綠色熒光，然后用顯微鏡就可以看到了。WB（VP16一抗）檢測發現，病毒感染細胞初期（0min），75%的病毒顆粒VP16陽性；在感染30min時，只有較少的病毒顆粒VP16陽性，而細胞質和胞膜上游VP16分布較多。在感染2~4h時，病毒顆粒VP16陰性，細胞質和核周有較多VP16分布。因此，在病毒移向細胞核的過程中，VP16從病毒顆粒上脫落，隨后分布于細胞質和細胞核（VP16具有核定位信號，我們將在后面介紹其功能）。

因此，我們可以推斷，在病毒從細胞膜沿著微管系統移向細胞核的過程中，大多數皮層蛋白病毒顆粒將脫落，暴露出核衣殼以便基因組釋放進入細胞核。當然，這些皮層蛋白的具體功能還有待進一步研究，我們這里只是大體講述皮層蛋白的綜合效應。

第三章 基因組入核

病毒入侵細胞，在含有基因組的衣殼體從細胞膜融合處移至細胞核周圍進入細胞核前，必須將其核衣殼體脫掉才能使其dsDNA通過核孔進入細胞核。基因組進入細胞核過程持續時間較短，因為病毒侵入細胞后即很快進入細胞核。這也說明，衣殼體很可能在移向細胞核的過程中即發生降解，或至少處于不穩定狀態以便接近細胞核后基因組的迅速進入。

研究表明，衣殼體移至細胞核附近，與核孔蛋白復合體相互作用，而后者與衣殼體蛋白的結合進一步觸發衣殼體的構象改變，從而促進其降解以及隨后的基因組進入細胞核過程。進一步的實驗則證明，衣殼體降解和基因組進入細胞核是密不可分的兩個連續的過程。

現有數據已證實，衣殼體蛋白UL6、UL25在衣殼體復合物降解過程具有極為重要的作用，其他衣殼蛋白的作用還有待于進一步確認。而且，由于皮層蛋白與衣殼體蛋白的密切相互作用，UL36和其他皮層蛋白也可能參與其中。其中，關于UL25的研究較為清楚。實驗發現，入侵宿主細胞后，皰疹病毒衣殼體沿微管網絡移至細胞核并定位于核孔復合體，隨后，病毒基因組釋放進入細胞核之前。實驗表明，在HSV-1感染細胞中有衣殼蛋白與核孔蛋白CAN / Nup214相互作用的證據，而沉默CAN/ Nup214后，可延遲病毒基因組在細胞核內復制的起始。實驗還表明，UL25與CAN/ Nup214和hCG1相互作用，并結合UL36和pUL6。這兩者分別是皰疹病毒顆粒組分中感染起始和病毒基因組釋放的重要蛋白。盡管這些結果確定CAN/ Nup214可作為皰疹病毒衣殼體的核受體，但是其配體尚不清楚，而UL25可能只是提供了衣殼體蛋白和核受體蛋白的場所，隨后病毒DNA釋放到細胞核的過程也不明確。

還有實驗認為，病毒基因組的釋放并不需要其衣殼體降解，而是在通過衣殼體上的出口后，以雙股單鏈DNA的形式進入細胞核。衣殼體不進入細胞核，似乎也不再發揮其他生物學功能。這個過程主要是UL6在發揮作用。但是，事實上，進入細胞核的病毒基因組，根本無法獨自直接開始其復制過程，而是先由VP16參與轉錄激活后才能開始復制。這說明皮層蛋白進入細胞核是通過不同的途徑進入細胞核的，盡管目前還沒有基因組和皮層蛋白進入細胞核的直接證據。

目前，有關基因組進入細胞核研究最多的當屬HIV。雖然HIV是逆轉錄RNA病毒，但是在其復制過程會產生dsDNA，其衣殼體外也有囊膜包裹，因此對皰疹病毒的基因組進入細胞核研究具有很好的啟示作用。當然，這僅僅是研究的一個切入點。現有的HSV-1脫衣殼步驟如下：（1）入侵細胞的衣殼體定位至核孔復合物（NPC）；（2）NPC的開放以及高壓力病毒基因組釋放；（3）病毒基因組通過NPC轉位至細胞核 (19)。最近有研究表明，MxB可以與HIV衣殼體結合，阻止HIV脫衣殼，從而抑制HIV的復制 。那么，MxB是否抑制HSV-1脫衣殼是值得研究的問題。

由于脫衣殼過程與病毒的核衣殼結構密切相關，也會讓我們想到古代成語——金蟬脫殼。下面我們簡要介紹一下衣殼體的結構。

衣殼體均由162個殼微粒組成一個二十面體的立體對稱結構，其中有150個是六聚體，12個是五聚體。這些殼微粒具有皰疹病毒的特征性結構，即每個殼微粒的縱切面中間均有一直徑4nm、長15nm的孔道。在五聚體和六聚體亞單位中，存在一種主要的衣殼蛋白VP5（UL19基因編碼），以及兩種次要的衣殼蛋白VP19c（UL38基因編碼）和VP23（UL18基因編碼）。兩種次要的衣殼蛋白形成三聯體結構，通常含有一個VP19c和兩個VP23。另外，還有一種次要的衣殼蛋白VP26，位于六聚體的外緣。由這些結構蛋白組成的五聚體和六聚體亞單位裝配成為病毒核衣殼之間，需要一個內部的支架蛋白pre-rp22a(由UL26.5基因編碼)，這一蛋白與核衣殼體主要的結構蛋白的相互作用，決定了完整的核衣殼體趨向成熟。核衣殼體的成熟過程，咱們后面會說到。【參見綠皮書】

密度梯度離心實驗發現，在HSV感染細胞的過程中，常可見三種形式的HSV核衣殼，即A、B、C三型。A型核衣殼是空衣殼，其中無DNA，也無DNA結合蛋白；B型核衣殼有DNA結合蛋白，少有或沒有DNA；C型核衣殼有DNA，但少有或沒有DNA結合蛋白。對這些不同形式的核衣殼的分析表明，C型核衣殼因含有完整的病毒DNA，可以發育為具有感染力的病毒顆粒；B型核衣殼則能夠進一步裝載DNA而轉化成C型核衣殼；A型核衣殼則可能因為缺乏DNA結合蛋白而始終以空衣殼的形式存在。關于核衣殼，我們能夠說的就這么多了，但是核衣殼在病毒從細胞膜移向細胞核的過程中的作用還有待于進一步研究，比如多功能蛋白UL13和Us3的作用等等。

金蟬脫殼
原文：存其形，完其勢①；友不疑，敵不動。巽而止蠱②。

注釋：①存其形，完其勢，保存陣地已有的戰斗形貌，進一步完備繼續戰斗的各種態勢。②巽而止蠱：語出《易經?蠱》卦。艮在上卦，為靜；巽為下卦，為謙遜，故說“謙虛沉靜”，“弘大通泰”是天下大治之象。

譯文：保存陣地的原形，造成還在原地防守的氣勢，使友軍不懷疑，敵人也不敢貿然進犯。在敵人迷惑不解時，隱蔽地轉移主力。）

第四章 心有所屬

好了，我們已經走了一段路了。那么，咱們前面說的屌絲（病毒）愛上女白領（宿主細胞）也應該有下文了。咱們上次說到屌絲撞到女白領，一見鐘情并以身相許。在屌絲的狂轟濫炸之下，女白領終于投降。今天是他們大喜的日子。他們結婚了。病毒千辛萬苦的努力之后，也終于到了最為關鍵的時刻——洞房花燭。

在這里，我還要誠實的告訴大家，到目前為止，病毒基因組復制的具體機制并不清楚。現有的研究主要是與基因復制、轉錄表達和各種特定功能所需修飾相關的核內組合體——ND10（nuclear domain）。

ND10在形態上曾被叫做核小體，也稱作早幼粒白細胞白血病蛋白體（PML）,它在核內以直徑0.2~1um的核狀結構存在，數量范圍約為5~30個。有實驗表明，HSV-1病毒在感染細胞時，其基因組DNA常常附著于PML小體上。而且，DNA的復制過程亦與PML小體具有拓撲學上的相關關系。同時，其他病毒，包括HCMV和腺病毒、SV40等也具有基因組DNA附著于PML的特性。這些現象似乎提示，當病毒移至細胞核膜，將其基因組DNA經核孔注入細胞核內后，病毒基因組DNA分子能夠以PML小體為靶部位。而且，實驗已證實，僅僅是那些能夠最終形成完整增殖性感染的病毒，才會出現其基因組DNA靶向移動至PML并停留于此。這似乎意味著，病毒基因組DNA停留于PML小體，是因為病毒DNA需要PML小體的相關組成成分為其提供一個高效率轉錄的活性部位。有關HSV-1的研究表明，HSV-1基因組DNA定位于PML的基本前提是病毒的復制轉錄起始子Oris、具有轉錄調控活性的ICP0和ICP27蛋白以及PML小體的組分之一Daxx。【參見綠皮書】

另外，PML還參與皰疹病毒基因DNA的復制過程，但具體機制尚在進一步研究中。其中，研究較多的是病毒蛋白ICP0對PML小體降解作用。有實驗發現，當HSV-1感染細胞時，常常會出現PML小體被破壞的現象。ICP0可同時與泛素相關蛋白酶體和PML小體結合而破壞PML小體，隨后，其組分常在病毒基因組復制區域繼續聚集，這些現象提示病毒基因的復制需要PML小體的相關成分。但具體是哪一成分，則至今都沒有明確的回答。但是，又有實驗發現。PML小體的破壞與否似乎并非是病毒DNA復制的絕對條件，因為ICP0缺失病毒仍然能夠在細胞中正常進行DNA的復制，PML小體依然可以識別病毒基因組DNA復制的區域。基于這樣的觀察，有人認為，PML小體對病毒基因DNA復制的進行具有特殊意義，但不是絕對必需的。

更深入的研究提示，HSV-1的復制的確需要PML小體，因為HSV-1基因中形成復制的區域仍然是其基因與PML小體的相關結構。而這一區域缺失包括了ICP0和PML小體的相關結構。另外，只有在這一結構中，HSV-1基因DNA的復制才是最有效率的。同時，功能分析也提示，被皰疹病毒相關蛋白破壞的PML小體成分，常可以通過抑制依賴于PML小體的抗病毒反應而加強病毒的復制。

下面我們簡要總結一下病毒基因組DNA入核后的一系列反應。病毒基因組入核后，基因組DNA靶向定位于PML小體。事實上，PML小體具有抗病毒作用，然而病毒的皮層蛋白ICP0具有E3泛素酶作用，可以破壞PML的結構，釋放出病毒可以用于復制的細胞因子（不清楚具體因子是什么）。實驗證明，感染細胞的病毒線性DNA很快形成環狀的復制中間體。隨后，病毒有可能同時以δ復制和θ復制的方式開始DNA復制過程（具體的復制過程咱們后面會說），從而完成病毒基因組DNA的復制。

第五章：始于足下（VP16的轉錄啟動作用）

說實話，從VP16啟動病毒基因組并開始表達蛋白到病毒顆粒包裝完成直至釋放才是病毒學的核心內容，因為我們在前面講到的所有的病毒蛋白都是在轉錄啟動的條件下產生的。

當皰疹病毒進入宿主細胞后，在一系列分子生物學事件的支持下，其基因組DNA將穿過核膜進入細胞核，這一過程依賴于病毒核衣殼的特定蛋白分子與細胞內某些分子，如微管蛋白的相互作用（咱們前面已經加以討論）。當病毒基因DNA分子進入細胞核后，將出現一個由宿主細胞RNA聚合酶Ⅱ復合體介導，并由病毒皮層蛋白VP16啟動的轉錄啟動事件。這一事件涉一些胞內蛋白分子，如Oct-1、HCF等，這些細胞蛋白與病毒蛋白形成的聚合體多蛋白復合物，將結合至皰疹病毒基因組中α基因的啟動子區域，以順式激活的方式啟動5個α基因產物（以HSV-1為例），即ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47的轉錄，從而啟動病毒基因組線性轉錄過程。隨后，β基因產物開始產生（病毒DNA復制相關酶均為β基因產物），病毒基因DNA分子也開始復制。當γ基因產物（多為結構蛋白）也順序被轉錄并翻譯形成后，復制完整的基因即可作為子代病毒的基因組用于新病毒的裝配合成了。

現有資料證明，在HSV病毒進入細胞后，使α基因轉錄啟動的主要病毒功能蛋白就是VP16。VP16對HSVα基因的轉錄激活，主要針對幾個病毒即刻早期基因，即ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47的編碼基因5’端非編碼區中的一個特定序列——TAATGARAT（R為任何嘌呤堿基核苷酸）起作用。但是，在DNA結合實驗中，VP16并未顯示出與任何DNA序列結合的能力，而對真核基因的轉錄調控的認識已經清楚地表明，轉錄調控因子與DNA特定功能基序的結合，是發揮轉錄激活或抑制作用發的結構前提。因此，既然VP16也具有轉錄激活功能，則其必定有相應的輔助因子。實驗證明，VP16對特定DNA序列TAATGARAT的特異作用是基于其與胞內轉錄蛋白Oct-1的相互作用而實現的。但實驗表明，在只有這兩個成分存在的情況下，VP16與Oct-1的結合作用非常弱，并不能形成穩定的復合結構，除非有第三個蛋白——同屬于胞內的調控蛋白——HCF的存在。但有意思的是，HCF既不與TAATGARAT結合，也不是從結構上連接VP16和Oct-1、它的存在意義在于誘導VP16出現一個構象的變化，使得VP16呈現一個新的空間結構而以較高的親和力與Oct-1以及TAATGARAT序列立體結合。HCF激活VP16以形成一個包括HCF、VP16和Oct-1的復合體，特異識別并結合TAATGARAT序列的機理和過程不清楚，但的確是VP16產生HSVα基因轉錄激活的基本前提。因此，在某種意義上，我們可以認為，HCF的存在及功能對于VP16功能的發揮具有決定性意義。一些尚未肯定的實驗表明，在缺乏Oct-1的情況下，如Oct-1基因缺失的細胞中，VP16和HCF的結合也依然可以誘導HSVα基因的基礎表達。但在HCF缺乏的情況下，則VP16的轉錄激活功能將完全喪失。

早期的研究對Oct-1作為轉錄因子對特定序列TAATGARAT的結合在VP16轉錄激活過程中的作用也有過詳細的分析。從現有資料看，由Oct-1介導的VP16的轉錄激活機制應該是HSVα基因轉錄表達的主流機制。對Oct-1及其他家族成員的細胞生物學結構分析表明，這個具有特定保守序列的蛋白有兩個結合DNA的亞結構域，即POUs和POUn，前者指能與特定（specific）DNA序列結合的結構域，而后者為能與同源DNA序列（homeo-）結合的結構域。進一步的生物化學分析表明，VP16和Oct-1結合的特定部位在POUn區域中，而對于VP16來說，其與Oct-1結合的區域也在VP16-Oct-1-HCF復合體結合DNA靠近α基因啟動子的部位。另外，VP16中的GARAT基序在該序列與Oct-1結合的過程中能夠誘導POU結構域的構象變化而引導Oct-1-VP16-HCF復合體的形成，而后者直接導致了VP16對α基因啟動子序列的識別。

作為皮層蛋白，當HSV-1進入細胞后，VP16即可以病毒的結構成分而發揮作用。有實驗表明，當以重組病毒方式將VP16和GFP融合表達時，可以在病毒感染細胞后見到VP16主要聚集在細胞核與病毒復制相關的區域，但同時可在細胞質內存在，而且先是呈彌散狀，在聚集到類囊狀結構細胞器中，如高爾基體。同時，作為結構蛋白，VP16需要在病毒組裝時進入子代病毒的顆粒中，畢竟HSV-1的皮層蛋白組分約占病毒核衣殼體積的50%。另外，有實驗明確提示，VP16分子上的特定區域可以與RNA聚合酶Ⅱ復合物中的亞基TFⅡB發生相互作用，而這一作用與VP16的轉錄激活功能直接相關。還有實驗表明，VP16可以與TBP、SAGA組氨酸乙酰化酶復合物發生相互作用，是以綜合多重作用蛋白質的方式發揮功能的。目前，大家公認，VP16通過和Oct-1及HCF的結合只是其主要的作用方式，而與其他蛋白的相互作用，則形成其轉錄激活功能的調控機制。【參見綠皮書】

我們必須說明，VP16只能發揮轉錄激活，而不具備DNA結合作用，所以有人就提出一個問題，HSV在進化過程中，為什么沒有進化產生一個既含有轉錄激活結構域，又含有特異性DNA結合結構域的VP16呢？這樣的蛋白不是具有更高的轉錄效率嗎？為什么必須依靠于兩個宿主細胞的轉錄調控因子的特異結合呢？這個問題還要進一步的驗證，但很可能是病毒的一種生存策略。當然，由于VP16是一種多功能蛋白，我們的探索還將繼續。

信號通路實驗發現，VP16可參與逃逸宿主的天然免疫作用。雙熒光報告實驗顯示，VP16能夠顯著抑制IFN-β和NF-kB信號通路。那么，VP16是如何發揮抑制作用的呢？接下來，用VP16分別與信號通路的接頭蛋白質粒共轉染，檢測其熒光強度的變化，發現VP16在IRF-3（使其二聚化）而不是IRF-7水平抑制IFN-β的表達；隨后，在HSV-1感染條件下，采用Co-IP實驗檢測到VP16和IRF3相互作用。當然，VP16的其他功能，還有待于進一步研究。

第六章：即刻早期蛋白

接下來，咱們先來介紹一下VP16轉錄激活后誘導表達的第一個即可早期蛋白——ICP0。說起這個蛋白，我忽然想到“多才多藝”這個詞，為什么呢？因為ICP0是一個多功能蛋白。多才多藝常用于形容才子，比如江南四大才子，唐伯虎、祝枝山、文征明和徐禎卿。他們個個琴棋書畫，無所不知，無所不曉，博古通今，多才多藝。我們如果要給皰疹病毒學評選四個才子的話， ICP0一定榜上有名，而且是“四大才子”之首，相當于唐伯虎。

不過，作為一種病毒蛋白，ICP0可沒有唐伯虎那種花前花后、酒醉酒醒的生活，它只記得它的使命——轉錄調控。現有的資料表明，ICP0是一個能在病毒感染過程中表現多種不同功能的病毒蛋白，它不僅可與某些病毒蛋白發生相互作用并與病毒早期基因和晚期基因的轉錄，同時，它還可對某些細胞內的基因轉錄產生影響。因此，有報道認為，ICP0是一種具有普遍意義的轉錄激活蛋白。

對ICP0在病毒感染過程中的動力學分析表明，新合成的ICP0分子通常出現在細胞核內或核結構附近的位置，這些位置相對應的結構點就是ND10。其主要組成成分即為早幼粒細胞白血病蛋白體（PML），而PML又可結合其他在染色體構象調控（如組蛋白乙酰化、去乙酰化）中起作用的蛋白，如Daxx、CBP、sp100等。這些蛋白在與PML結合的過程中可以呈現天然構象或是小分子泛素化修飾的狀態。很明顯，ICP0在這些部位的聚集及與相關分子的相互作用，提示其可能影響細胞內某些與染色體基因轉錄相關的調控因子。隨著感染細胞內ICP0量的增加，其可逐漸在細胞核內彌散并充滿整個細胞核。感染后期，尤其是病毒基因組DNA合成已經完畢后，該蛋白則可在細胞質內檢出，這一現象事實上是ICP0通過某種尚未確定的機制（可能是與細胞周期蛋白D3）由細胞核移至細胞質導致的。還有報道認為，ICP0從細胞核移向細胞質的擴散過程中，同時促進了ND10結構的解聚及其組分，如PML、sp100等的降解。但這兩個事件是否有因果關系尚需進一步確認。還有實驗提示，ICP0和細胞內染色質組蛋白的乙酰化體系成分，如PCAF、CBP（二者也存在于PML聚集體中）之間有相互作用。而且，瞬時轉染系統的分析表明，這樣的結合可以細胞內乙酰化系統HAT的功能，并通過這一功能的改變而對病毒基因和細胞內某些基因進行調控，當然，這一初步結果尚需證實。

對ICP0功能的綜合分析還進一步提示，ICP0可能作為一種泛素連接酶而參與了細胞內泛素-蛋白酶途徑，具體表現為，首先是ICP0的C端結構（594-646位區）可以特異性地與USP7，即皰疹病毒自身編碼的泛素特異性蛋白酶相互作用；其次，ICP0可以促進幾種細胞蛋白的降解，并能誘導偶聯泛素在其定位基礎上的聚集，而且這一作用，正是由ICP0分子中的環指結構所決定的；最后，ICP0還能以一種特定的動力學方式，在感染細胞中和26S蛋白酶體產生相互作用，在蛋白酶體抑制劑存在時，ICP0即可穩定地結合在該蛋白酶體之上。我們知道，ICP0的環指結構具有明確的E3泛素連接酶的功能，而且，當其在感染細胞中和26S蛋白酶體結合時，又不被該蛋白酶體所降解。因而，從理論上講，ICP0應該是病毒在感染細胞中為控制細胞的泛素系統而編碼的組分之一，如果這個可能性的確存在的話，那么，病毒的這一設置，顯然是基于其本身的增殖策略而具有針對性的。前面談到，ICP0在感染細胞內可以引起PML、sp100等蛋白的降解，進一步的分析也證實，ICP0可能通過不同的方式，包括需要病毒蛋白編碼的USP7的參與，利用泛素-蛋白酶體途徑，降解PML、cdc34和sp100。而在這個過程中，ICP0的環指結構發揮了重要的泛素連接酶作用。

那么，作為HSV-1的一個即刻早期蛋白，ICP0為何要以如此復雜的方式參與這些細胞蛋白的降解，這樣一個特定細胞蛋白降解的生物學事件，對病毒增殖的意義何在？有實驗認為，盡管ICP0在其從細胞核移至細胞質的過程中引發PML的降解，但這一事件還有病毒蛋白UL13和Us3的參與。不過，PML的降解并不是病毒感染時其基因表達的重要基礎，可能和α基因表達之后的其他病毒基因表達有關。

當然，我們知道PML、sp100作為ND10結構中的重要組分，與細胞染色體組蛋白去乙酰化過程相關，既然如此，那么ICP0降解這些與去乙酰化功能相關的蛋白質是否是為了增強或利用細胞內與此相對應的乙酰化轉移酶（HAT）系統呢？因為細胞分子生物學研究已明確，乙酰化對于相當數量的基因轉錄調控具有重要的意義。盡管這些實驗還需要進一步深入的證實，但其確實提示了ICP0在病毒基因調控中發揮的特殊功能。

進一步的實驗提示，ICP0環指結構的破壞所引起的最明顯而直接的結果就是ND10結構能保持完整，而其中的幾個蛋白，如前面所提到的sp100、PML等也會繼續保持其穩定狀態。而這一穩定的結果，尤其是PML蛋白的穩定則可使細胞對在感染過程中產生的干擾素的敏感性的降低，這實際上增加了病毒對機體天然免疫系統的抗病毒反應的抵抗力（似乎矛盾，ICP0破壞降低了干擾素的敏感性？）。但是，這種抵抗力的增強和病毒基因或細胞基因的轉錄激活功能有何聯系，仍然不得而知。另外，還有報道認為，由于ND10在ICP0的作用下破壞，使得該結構內的轉錄因子得以釋放，從而加強了病毒基因和細胞基因的轉錄激活作用。不過，ICP0的轉錄激活作用對那些以轉染或感染方式引入細胞的基因并無明顯作用，這提示細胞中并不存在由于ICP0破壞ND10結構而釋出的轉錄因子。而其他的一些研究認為，ICP0的真正效應可能是類似于組蛋白去乙酰化酶的抑制劑，可增強組蛋白的乙酰化，從而加速基因的轉錄激活作用。這是個有意思的問題，但要證實這一點，則必須首先確定以感染或轉染方式引入細胞的病毒基因DNA或其他DNA，是否在進入細胞后立即細胞組蛋白所結合，并使這些DNA形成特定的染色體結構，因為只有這樣一個前提的存在，ICP0發揮促進相關蛋白乙酰化的作用才具有生物學意義。而且，有資料表明，在缺少ICP0時，只要有其他一些病毒蛋白存在，在細胞中所引起的病毒特定基因的沉寂也可以被克服。例如，在ICP0基因缺失的情況下，以高感染復數——即以高水平的VP16也可以保證病毒基因的完整表達，此時，能夠代替ICP0作用的病毒蛋白是ICP8，這是一個在感染過程中極早期表達的、具有DNA結合能力的蛋白。因此，有關ICP0的這一可能特性，還需進一步的研究。【參見綠皮書】

此外，還有資料表明，ICP0能夠與干擾素調節蛋白家族中的成員IRF3和IRF7產生相互作用，而這一通過ICP0環指結構域結合的作用是抑制這兩個干擾素調節蛋白介導的干擾素刺激基因（ISG）的激活。我們知道，干擾素通過刺激細胞產生多種功能分子，是抗病毒效應的直接直接執行者。這些相關基因的激活抑制，顯然可以影響或降低干擾素的抗病毒功能，而ICP0的這種作用，顯然是HSV在宿主細胞增殖的重要支持。此外，也有實驗發現，ICP0可以和細胞翻譯系統中的延伸因子18發生相互作用，而此作用可以改變在體外系統中病毒mRNA的翻譯效率，這一結果在HSV感染細胞內得到了證實。

總的來說，盡管ICP0被認為是一種病毒基因與細胞基因的轉錄激活子，但具有多種活性，能與多種病毒蛋白、細胞蛋白結合。所以，關于ICP0的功能還需要進一步研究。

接下來，咱們介紹一下ICP4、ICP27和ICP47。這里，咱們要說明的是，即刻早期蛋白的主要作用是轉錄調控β基因的表達，同時影響宿主細胞蛋白的表達。

在這5個即刻早期蛋白分子中，ICP4被初步確認為一種針對不同基因具有不同轉錄調控功能的分子，對于某些HSV本身的早期基因和晚期基因的轉錄激活過程，ICP4是重要的參與因素。因此，它對病毒感染過程中病毒的生長增殖是必須的。有資料表明，在瞬時轉染實驗中，ICP4的存在的確能激活多種基因，包括病毒基因和某些細胞基因。某些體外實驗還表明，ICP4還能夠增加其核系統環境中轉錄起始復合物形成的比例，這是通過促進轉錄起始復合物的成分中TFⅡD與DNA序列上TATA元件的結合而完成的。當然，ICP4分子內也有DNA結合區域，但在病毒早期或晚期啟動子中針對ICP4的特異基序至今尚未最終確定。

另外，有實驗表明，由于即刻早期蛋白（如α-0與α-4）啟動子與早期及晚期蛋白啟動子中TATA元件前后的序列有所不同，因此ICP4對α-0與α-4基因的轉錄激活呈現抑制作用。但也有實驗認為，這是由于ICP4與轉錄起始復合物的成分TFⅡB相結合而導致的。盡管這些資料均未得到統一的結論，但是ICP4作為一種α基因的產物，表現出對早期和晚期基因的轉錄激活和對α基因的轉錄抑制，本身就提示α基因產物對β基因和γ基因轉錄的調控作用。【參見綠皮書】目前，關于ICP4轉錄激活早期和晚期基因的機制尚未完全解釋清楚。

從結構上看，ICP4具有幾個功能結構域，其中包括DNA結合區域，核定位區域和轉錄激活區域（TAD）。因此，ICP4在發揮其轉錄激活作用時，可以和DNA分子、TBP和TFⅡD形成復合物。實驗表明，ICP4與TFⅡD結合的基礎是ICP4與TBP相關因子（TAF）的結合。當然，這個復合物是針對病毒啟動子的TATA元件。有實驗對其與其他細胞分子形成復合物而結合于病毒基因啟動子的分析表明，它需要結合并依賴多種細胞因子才能發揮其病毒基因轉錄激活效應。

HSV的另一個即刻早期蛋白ICP27，也對病毒早期基因和晚期基因的轉錄啟動有重要的意義。但是，與ICP0（降解PML以釋放轉錄成分）和ICP4（雙重轉錄調控）不同，ICP27的存在主要是使病毒早期基因和晚期基因的轉錄本（mRNA水平）在感染細胞中聚集以保證病毒的復制，而將其基因敲除后的突變病毒將無法在感染細胞中實現正常的生長增殖。

ICP27也是一個多功能蛋白，而其功能實現則是通過它與多種細胞內蛋白質分子的相互作用。例如，ICP27通過與細胞內的RNA聚合酶Ⅱ全酶相互作用而實現對早期基因和晚期基因的轉錄啟動。而同時，ICP27又能與細胞內RNA剪接體相關蛋白發生相互作用。實驗表明，ICP27可與pre-mRNA剪接體相關蛋白P145（SAP145）相互作用，這一作用的直接結果就是細胞內相關的pre-mRNA剪接效率受到抑制。除此之外，ICP27還能與另一個剪接相關蛋白P32相互作用。P32是一個可以通過抑制ASF/SF2剪接體與RNA的結合和磷酸化而調節RNA的剪接，它與ICP27相互作用可以影響這一調節。有實驗表明，ICP27可以引起細胞質內未剪接的細胞mRNA聚集，這一現象很可能與上述其與細胞RNA剪接系統的相互作用相關。結合ICP27對病毒早期基因和晚期基因轉錄的促進作用，這些資料顯然提示ICP27在發揮自身對病毒的功能之外，還同時通過與細胞相應的蛋白相互作用而影響細胞RNA剪接來完成對病毒增殖的支持。

另外，還有實驗表明，ICP27還能與細胞內的CK2和異源性核糖核蛋白K（hnRNPK）發生相互作用。我們知道，CK2是一種多效、非特異性的蛋白激酶，在HSV感染早期，ICP27即可刺激CK2從核內分布到細胞質，同時，CK2也能在受到ICP27刺激后使ICP27磷酸化。更為重要的是，此時的CK2還能使hnRNPK發生非正常的磷酸化，使hnRNPK的活性發生改變。而事實上，hnRNPK本身也是一個多功能蛋白，它可以在細胞核與細胞質之間來回轉運，其可能的功能是進行pre-mRNA轉運相關的活動。ICP27直接和通過CK2對pre-mRNA的影響，顯然會對細胞本身的剪接系統產生相應的影響。有意思的是，實驗還表明，ICP27還能與細胞的另一轉運因子Aly/REF相互作用，并借此從細胞內的剪接體募集Aly/REF，以用于將病毒的一些無內含子的RNA轉運出細胞核。同時，也有實驗表明，ICP27還能與TAP/NXF1相互作用，這個蛋白也是將細胞內mRNA轉運出細胞核的受體蛋白。這些作用之間的相互關系是一種什么樣的機制至今尚不清楚，但是討論至少提示ICP27是以一種多重方式為病毒在感染細胞過程中的復制戰略的某一層面——mRNA處理層面——提供系統支持。此外，還有實驗表明，ICP27也可能以特定的機制發揮激活NF-kB信號途徑的作用。雖然這一功能還不清楚，但以NF-kB復雜的生理效應，如果這一觀察被證實的話，顯然還有更多的可能性會由此產生。

至于HSV的另一即刻早期蛋白ICP47，則具備完全不同的功能——ICP47是調節MHCⅠ類分子表達的重要病毒蛋白。研究表明，HSV編碼的ICP47蛋白是一個位于細胞質的分子，它能阻斷細胞內的MHCⅠ類分子在內質網及其他細胞器間的轉運和成熟。該事情提示，ICP47蛋白對MHCⅠ類分子的可能靶點在其產生后開始組裝為復合物的階段。目前的機制認為，ICP47的作用靶點為TAP1/TAP2復合物。免疫沉淀和免疫熒光技術首先證明ICP47和TAP1/TAP2復合物的相互作用以及細胞內的共定位，并進一步證實在與ICP47結合后，TAP1/TAP2復合物失去了裝運蛋白多肽以及結合MHCⅠ類分子的能力。其結果不僅使MHCⅠ類分子結合及呈遞抗原多肽的途徑受到阻礙，同時還能使未與抗原多頭結合的空MHCⅠ類分子迅速降解。在此過程中，可以看到ICP47的特定能力使得HSV感染所可能誘導的免疫反應效率明顯受到影響。盡管從系統的角度可以設想，ICP47的作用不可能阻斷所有關于HSV抗原的呈遞，同時，ICP47在病毒感染過程中產生的時間亦決定了其不可能作用于HSV感染時免疫反應的全過程。但是，這一作用至少可以為HSV感染贏得一定的時間，使其免受免疫系統的攻擊，這作為HSV調控免疫細胞而保護自身生存的策略之一，顯然具有相應的意義。【參見綠皮書】

最后，咱們再稍微總結這些蛋白的功能并做些合理性地解釋。ICP0、ICP4和ICP22參與轉錄激活，調控早期基因和晚期基因的轉錄（轉錄水平）；ICP27主要在pre-mRNA水平上調控宿主蛋白和病毒蛋白的表達（翻譯水平）；ICP47抑制抗原肽-MHCⅠ類分子的呈遞，避免病毒入侵的細胞受到免疫系統的攻擊。在病毒感染細胞早期，所有即刻早期蛋白的核心任務就是為病毒的生存和增殖創造條件，此刻，生存大于一切。

我們可以這樣認為，病毒感染宿主細胞后，囊膜與細胞膜融合，病毒顆粒沿微管蛋白由細胞膜移向細胞核，與此同時，含有核定位序列的皮層蛋白VP16脫落并通過某種機制入核。VP16與HCF、Oct-1形成復合物，并識別并結合通過核孔進入細胞核的病毒基因組DNA即刻早期基因啟動子區域。隨后，5個即刻早期蛋白開始順次表達并發揮相應的功能。（至于命名原則，個人認為是依據蛋白起始密碼子相對于啟動子0的相對位置，比如α0是從啟動子0位開始，純屬虛構，僅供參考）。

ICP22之所以放在最后來說，是因為ICP22基因還能編碼一個小一些的同源蛋白Us1.5。作為一種即刻早期蛋白，ICP22也是一個根據不同環境而表現不同功能的調控因子（轉錄水平）。有報道認為，ICP22可以通過增強細胞周期蛋白cdc2以來的激酶活性而使細胞周期A和細胞周期蛋白B的降解減少而促進HSV晚期蛋白（γ2）的表達，這似乎是一種正調控作用。而且，ICP22被Us13磷酸化后，還可以促進晚期蛋白UL38, UL41, and Us11的表達。但也有實驗表明，在瞬時轉染系統中，ICP22可以表現出對多種啟動子結構，包括HSV的α、β、γ基因啟動子和某些細胞啟動子的轉錄抑制作用，似乎與該蛋白和啟動子中的共同元件TATA基序的作用有關。但是，ICP22的抑制作用在VP16的存在下可能被解除，因此提示ICP22可能與VP16一道，共同形成了病毒感染時對病毒α基因轉錄激活的正負調控機制。當然，有關這一機制的詳細機理尚待進一步的探索。

事實上，作為即刻早期蛋白，ICP22的關注遠不如其他成員如ICP0、ICP27等。下面，結合近年的幾篇文獻，我們可以更深入的了解ICP22的轉錄調控作用。

Bernard等發現ICP22可以與細胞周期蛋白cdc9相互作用并進一步調控晚期蛋白的表達。實驗表明cdc9能夠介導轉錄修飾后的ICP22與RNA Pol Ⅱ 相結合，并使其在轉錄復合體水平影響病毒蛋白的轉錄。不過，ICP22發揮這種功能的前提條件就是ICP22要被UL13磷酸化。但是，我們不得不考慮的是，UL13是一種晚期蛋白，所以這種調控極有可能是在病毒周期晚期發揮作用。Lei Guo等人的實驗證實，ICP22和VP16都可以直接與轉錄延伸因子P-TEFb結合并在細胞內形成復合物。P-TEFb通過絲氨酸位的磷酸化RNA Pol Ⅱ以調節其轉錄延伸活性，從而調控mRNA的表達。這似乎進一步驗證VP16和ICP22通過P-TEFb在轉錄水平對α、β和γ基因的表達形成正負調控機制。當然，這也為HSV-1感染細胞后基因表達的調控機制的探究提供更多證據。ThomasW. Bastian等從另一角度研究ICP22的功能。實驗表明，ICP22可以與Hsc70共定位并誘導VICE（病毒誘導伴侶蛋白富集體，包括伴侶蛋白、蛋白酶體和泛素蛋白）的產生，從而促進病毒的復制。不過，與ICP0缺失病毒一樣，ICP22缺失的病毒也可以在Vero細胞中生長。這似乎提示，ICP22可以通過其他細胞因子來調控病毒基因的表達。總的來說，ICP22也是一個參與病毒基因和宿主基因調控的多功能蛋白。它的主要作用機制似乎也是通過與宿主細胞因子相互作用，并通過多種機制發揮轉錄調控功能。但是，作為一種即刻早期蛋白，ICP22的作用的確需要我們更多的關注。

作為ICP22（亦即Us1）的同源蛋白，Us1.5的功能也受到人們的關注。Us1.5的啟動子和編碼區域均包含在α22中，而且大多數ICP22的功能也與Us1.5的開放讀碼框（ORF）相關。因此，咱們在這里不再具體介紹Us1.5的功能。

第七章：按部就班（復制、轉錄相關病毒蛋白）
朋友，謝謝你能讀到這里。咱們已經走完一半的路程了。但是，革命尚未成功，我們仍需努力，因為接下來的任務更加艱巨。

我們知道，在病毒基因組DNA進入細胞核后，在VP16的轉錄起始作用下，5個α基因得以轉錄表達。隨著轉錄事件發生及其線性程序的進行，25個早期蛋白（β基因）開始表達，其中最重要的早期蛋白（E蛋白）為復制相關蛋白，它們均由位于UL區域的基因編碼，分別是：UL5、UL8、UL9、UL29、UL30、UL42、UL52。同時，一些已存在于病毒蛋白體內的蛋白分子也將按照固定程序發揮作用，使得病毒基因DNA的復制隨之啟動。客觀地講，這一時段是在病毒感染細胞2~3h時，其中有些步驟在病毒基因發生轉錄事件時就已同步進行。例如，某些蛋白分子在核內前復制位置的定位、與DNA分子的結合等。但是，嚴格地講，這一過程還是在其所需的相關病毒蛋白已準備完畢的情況下，按照蛋白質-蛋白質、蛋白質-DNA相互作用所遵循的動力學規則順序進行的。此過程中，HSV按照一種與許多其他人類病毒不同，而與某些細菌病毒相似的方式操作的，它存在兩種模式，即θ復制和δ復制。這兩種復制模式的結合，最大限度地利用了病毒基因結構的特點，使其能夠以有限的空間和時間資源，盡可能有效地復制子代病毒。【參見綠皮書】

在詳細介紹病毒復制之前，我們有必要先了解HSV-1基因組的基本結構。和其他皰疹病毒相同，HSV病毒基因結構為雙股線性DNA，當然，在病毒顆粒中，這一DNA基因組是以環形或是軸線狀被包裹在衣殼中的。此時，該DNA分子的末端常常是交疊在一起或是保持很近的距離，這種形狀的機制顯然是為了病毒顆粒在感染細胞時，一旦核衣殼結構破壞，HSV的DNA分子即可形成環狀結構而經核孔進入細胞核，以便于轉錄和復制。HSV病毒DNA分為長片段UL (unique sequence of long component)和短片段Us (unique sequence of short component)。這兩個片段為單一序列，其兩側為重復序列，而末端的重復序列（a序列）是高度保守的，它們僅出現內部重復序列數量上的變化。

實驗表明，在病毒感染細胞半小時后，盡管細胞內還沒有任何病毒蛋白，但病毒基因組DNA就已經可以在細胞核內檢出，而此時在核內開始積累的病毒基因DNA所呈現的形式是一種無游離尾端的構型，這種構型的基因DNA隨即形成環狀結構。具體機制是HSV基因末端均具有a序列，該序列的直接重復結構在未知原理下形成尾-尾相互連接，使整個基因分子在進入細胞核內后經過一個短暫的過程，即形成環狀的復制中間體。這種環狀DNA形式存在的基本意義，很可能是為一種已知的θ復制機制提供結構基礎，盡管這一點在HSV還未得到直接的最終證實。

目前，對HSV病毒基因組DNA結構的分析表明，DNA復制起始結構含有用于DNA復制的三個順式作用元件，它們均可以作為DNA復制的起始點，分別為一個OriL和兩個OriS，前者位于UL29和UL30基因之間，而后者位于內部重復短端（IRS）和尾部重復短端（TRS）的C序列中，大致是ICP4和ICP22/47基因之間的位置。該推斷的實驗證據是觀察到DNA復制泡首先出現在相應位置，即UL區域和IRS/TRS部位，而對DNA復制的序列分析也能定位于此。另外的實驗也表明，DNA復制最先合成的DNA序列亦是UL-Us結合部的序列。

對上述結構的進一步分析表明，OriS和OriL分別含有一個45bp和144bp的回文序列，中部有一個18~20bp富含A+T的區域，而此區域的側翼是特定的重復序列，可由病毒UL9基因編碼的DNA起始結合蛋白特定識別。在OriS結構中，一側能與該蛋白產生高親和性結合的區域BoxⅠ，而另一側的BoxⅡ則只能以1/10的親和力與這一蛋白結合。同時，OriL有2個BoxⅠ拷貝，而OriS只有1個。盡管BoxⅢ與BoxⅠ有很接近的結構，但僅以一個堿基的差異，就表現為與DNA起始結合蛋白的低親和性。而相關的實驗表明，OriS的有效復制起始作用需要兩個DNA起始結合蛋白識別部位的完整結構，即BoxⅠ和BoxⅡ。這樣一種結構以及OriS和OriL都作為DNA復制起始位點的機制尚不清楚，但根據對這兩個起始部位的分析和現有的DNA復制模型，可以認為二者的存在都應該是符合其功能需要的。Loss-of-function實驗表明，即使將兩個OriS都去除，也不會完全影響病毒DNA的復制，這似乎提示，HSV基因DNA的復制有可能同時以θ復制和δ復制的方式進行，而且二者都可由OriS或OriL執行。所以，這兩個起始點的結構并無明顯的功能意義上的區別。

目前，關于HSV基因DNA復制的具體機制還沒有完全解釋清楚，但從許多不同的報道中，可以理出一個基本的模型和過程。簡單地說，這個模式的中心環節就是，病毒基因組在借其特殊結構形成環狀結構之后，其DNA分子復制過程的起始借助于一個可在λ噬菌體中可見的θ模式進行。隨后DNA分子以滾環方式不斷復制出子代的基因組DNA，其以串聯體形式產生，再經酶解包裝成單個的DNA分子，這一過程涉及了多個病毒基因自身編碼的功能蛋白的相互作用。同時，病毒也可以利用宿主細胞的某些功能酶分子，如DNA聚合酶-引物酶來完成這一事件，但不依賴于這些宿主蛋白。下面我們根據現有的資料，大體介紹病毒的復制過程。

關于病毒DNA復制的模型，已經肯定的是，首先應該是UL9基因編碼的蛋白（起始結合蛋白）結合到病毒DNA具有高親和力識別的復制起始部位，即前面提到的BoxⅠ。隨后，UL9形成同源二聚體并募集其他起始結合蛋白輔助分子結合到較低親和力的識別部位，如BoxⅡ和BoxⅢ。隨后，UL9（起始結合蛋白）通過其C端的DNA結合結構域進一步結合ICP8（UL29，單鏈DNA結合蛋白），后者可以刺激起始蛋白所具有的DNA解旋酶活性和ATP酶活性。這樣，病毒DNA雙鏈分子出現解旋狀態，并形成單鏈構象以便于下一步DNA分子的復制。

隨后，UL9通過其N端結構結合UL8、UL5的基因編碼產物（均為DNA復制蛋白亞基），并由此將引物酶活性引入復制起始復合體，但該酶并不以OriS的基本結構作為模板，而是隨著復合體對DNA起始部位雙鏈的解旋，以起始部位旁側的序列作為模板。有資料表明，起始結合蛋白亦能以同樣的方式結合到人源細胞內的DNA聚合酶復合體中的α引物酶，并形成復制過程所需的起始引物以便復制鏈的延伸。這意味著HSV病毒基因的復制可以使用自身的引物酶，也能使用宿主細胞的α引物酶，這一策略顯然是十分有用的。

在DNA雙鏈解旋以及起始引物合成之后，UL9即完成了任務，并與DNA分子解離，而此時，未解旋的DNA區域仍由ICP8蛋白分子結合。隨后，ICP8通過特定方式結合HSV本身的DNA聚合聚酶體——包括UL30、UL42、UL52基因編碼的亞基部分——并促進聚合酶發揮作用。由UL30和UL42構成的二聚體可以催化前導鏈的合成，但后隨鏈的合成則是由UL30單獨地、總是低效率地完成的。

事實上，病毒基因組DNA在復制的同時，轉錄相關酶（部分β基因）也開始表達并發揮功能。轉錄調控是比復制過程更為復雜的細胞活動，具體機制也是撲朔迷離，公說公有理，婆說婆有理。但是，從病毒的角度看，一切的核心其實就是完成核衣殼蛋白的組裝，并包裹病毒DNA以完成其復制周期。

按照中心法則以及生化知識，我們可以知道，病毒會在轉錄（包括轉錄后調控）、翻譯以及翻譯后修飾等各個水平影響調控自身蛋白的表達。咱們在前面介紹的ICP0（降解PML）、VP16（轉錄起始）、ICP27（pre-mRNA剪接）都是病毒調控蛋白表達的實例。我們可會發現，病毒蛋白表達的調控通常是與宿主細胞因子相互作用共同完成的。下面咱們結合UL41和γ34.5對宿主翻譯系統的影響來具體談談病毒蛋白的調控功能。

和其他人類皰疹病毒一樣，HSV感染宿主細胞過程中依次出現α基因、β基因和γ基因的轉錄表達，除了α基因（即刻早期蛋白）的表達，β基因和γ基因既編碼病毒的結構蛋白，也編碼用于病毒基因復制和細胞翻譯系統的功能蛋白。其原因很簡單，所有的病毒增殖所需的功能和結構蛋白都需要通過細胞的翻譯系統而產生。事實上，在感染宿主細胞3h內，HSV可使宿主細胞蛋白的合成和mRNA水平下降90%。顯然，隨后的現象就是病毒的蛋白迅速上升呈主導地位。從分子生物角度講，這一過程實際上是由病毒多種蛋白執行的多種機制所導致的，總體上可分為兩個階段。第一階段是宿主細胞內原先存在的多聚核糖體迅速降解，以及一些細胞mRNA和病毒mRNA的迅速降解。這一過程發生迅速，通常在病毒感染的早期即可出現。而第二階段則是宿主細胞蛋白合成體系在感染的過程出現關閉，其出現的前提是某些病毒基因已經得以表達。換句話說，HSV感染后導致細胞出現的宿主蛋白合成是以不同時段中由不同機制引起的。

應該說，HSV影響宿主細胞蛋白合成的詳細機制至今還留有許多疑問。但是，初步的分析表明，在第一階段宿主蛋白合成系統關閉的過程中，至少有一種病毒蛋白——病毒宿主關閉蛋白（VHS，virion hostshut-off,該蛋白由UL41基因編碼）——發揮了作用。VHS可使mRNA去穩定，這在一定程度上導致了多聚核糖體的解離。我們知道，VHS是一種皮層蛋白，在病毒感染早期即可釋放進入細胞質發揮作用。因此，其在感染的極早期發揮作用就是可以理解的了。但有關VHS降解mRNA的機制還不確定，只有一些實驗供我們推到理解。首先，當將來自未感染細胞的多聚核糖體和自HSV感染細胞的細胞質上清共同孵育時，可以導致用于實驗的穩定的mRNA分子迅速降解。其次，從HSV病毒毒粒制備的VHS蛋白粗體物或者是含有VHS的網狀紅細胞裂解液可以明顯的增強RNA酶的活性，但若是使用VHS的突變體蛋白則對RNA酶無類似影響。最后，利用抗VHS抗體可以在非細胞系統中抑制VHS在上述情況下所表現的RNA酶增強功能。這些證據表明，VHS蛋白的確通過增強RNA酶活性而降解mRNA的功能。不過，當將純化的VHS蛋白與mRNA分子共同孵育時，則未見VHS對mRNA分子的降解。這提示VHS還利用了另外未知的細胞因子介導其對RNA酶活性的增強。另外，還有實驗表明，在HSV感染細胞中，具有多聚腺苷結構的mRNA分子比無多聚腺苷信號結構的mRNA表現出更快、更明顯的降解作用。同時，去腺苷化的mRNA分子在HSV感染的細胞中可見明顯的聚集。這似乎提示了VHS蛋白具有針對多聚腺苷信號序列的識別結構，但這樣的結構在VHS中尚未確定。不過，進一步的研究則提示，VHS似乎是通過與PABP復合物的結合而定位于poly（A）的位置。綜上所述，VHS確實可能通過細胞內核糖核蛋白（RNP）復合體中的某些特定因子而發揮作用，而且執行此功能是以自身和/或其他因子的協同作用并在一至數個關鍵位點，例如poly（A）的位置，切割降解mRNA分子。有趣的是，這個位置實際上是細胞mRNA分子為了逃避宿主RNA酶的降解而具有的結構。【參見綠皮書】目前研究認為，VHS是與eIF4B、eIF4H協同完成其降解功能的，eIF4F也發揮部分作用。但是其降解的mRNA序列的特列的研究尚無進展。

除了VHS的研究，另一焦點就是病毒蛋白γ34.5。（VHS在mRNA 水平，而γ34.5在翻譯后修飾水平發揮作用）。通常在一些病毒感染的細胞中，病毒復制過程中產生的一些高度結構化的雙鏈RNA（dsRNA）可以結合并激活宿主細胞內的PKR（蛋白激酶R），后者隨之使eIF2α分子磷酸化，這導致的直接結果就是細胞的翻譯系統喪失其功能活性。同時，病毒的蛋白合成及復制也將在感染細胞中受到抑制。有實驗表明，在缺失γ34.5基因的HSV的感染中，這些病毒不能在人類的一些惡性腫瘤組織生長，而同時這些細胞表現出較高的PKR表達和活性，也可見到其eIF2α的磷酸化極為明顯，使得病毒感染的細胞過早出現蛋白合成的關閉，而導致病毒的生長受到阻滯，而且這一過程不是由VHS的蛋白合成關閉功能和mRNA 降解引起的。

事實上，隨后實驗亦表明γ34.5基因編碼產物確實以不同的作用模式參與上述事件。例如，酵母雙雜交實驗證明，γ34.5基因編碼產物能夠和細胞蛋白磷酸酶1α（PP1α）發生相互作用，進一步實驗表明，它們可以形成復合物，而且含有這種復合物的組分可以使純化的eIF2α分子發生去磷酸化作用。換句話說，γ34.5基因產物可以作為PP1α的調節子或是復合物的靶向性亞單位是其將eIF2α分子去磷酸化以中和PKR的活性。但此過程的具體機理還不清楚，因為還沒有實驗證實γ34.5基因產物和PP1α之間具有直接的相互作用。不過，有實驗提示，PP1α可以直接結合eIF2α并使其磷酸化，但是這種現象是否能在HSV感染的細胞中出現還不清楚。同時，還有實驗表明，病毒蛋白Us11編碼產物能夠補償γ34.5的功能。Us11可以與RNA結合并與核糖體相關聯，從而降低PKR的活性。

綜合這些自資料，我們可以看到，HSV至少編碼兩種蛋白——Us1 和γ34.5，通過靶向結合細胞的PKR和eIF2α來影響調控細胞的翻譯機器，而這兩種蛋白的作用顯然是相互協調和互補的。γ34.5基因產物中包含一個與細胞蛋白GADD34分子具有典型同源結構的區域，而GADD是細胞在受到一些終止生長、DNA損壞和特定分化信號刺激時所產生的一種蛋白質。而且，它可以和PP1α發生相互作用，并在γ34.5基因缺失的突變體病毒感染細胞中替代γ34.5基因產物的功能，以延長晚期蛋白合成。當然，其他病毒蛋白，尤其是皮層蛋白是否也在病毒轉錄、翻譯等過程中發揮調控作用還需要進一步探索。

第八章 建筑高手（衣殼形成和DNA組裝）

對于病毒來說，接下來的事情就順理成章了——組裝核衣殼體和裝配DNA。前面咱們已經介紹核衣殼的組成和結構，下面咱們主要介紹核衣殼體的裝配過程。

研究HSV-1感染的細胞中核衣殼體蛋白的相互作用并由此形成核衣殼體基本結構的過程是非常困難的，因為大量細胞蛋白和病毒蛋白的存在使許多敏感精細的技術無法確定這些結構蛋白之間的關系。目前，根據蛋白質相互作用的基本動力學原理，一種體外蛋白相互作用分析系統的技術得到了應用。

在此體系中，利用表達純化的方法得到相關病毒蛋白以期認識它們之間的關系。該實驗證實，VP23和VP19c具有明顯的相互作用的特性，這種特性使得兩個VP23趨于形成同源二聚體，而此同源二聚體又能夠與一個VP19c分子形成異源三聚體。這個三聚體在結構上表現為類三角棱體，是HSV-1核衣殼微粒結構中的重要連接結構。利用突變分析表明，在此三聯體結構中，VP19c的C端15個氨基酸與整個三聯體的結構活性直接相關。去掉這15個氨基酸的VP19c仍然能夠與VP23反應，但是該三聯體將不能作為核衣殼體的結構單位實施功能。由此可以認為，VP19c的C端可能是與主要的衣殼蛋白VP5相互作用的部位。與此相反的是，VP19c的N端則與三聯體的結構活性無關，當去除N端的90個氨基酸時，該三聯體仍然形成最終的前殼體結構，但是當去除N端的105個氨基酸時，該三聯體的結構活性明顯丟失。這提示，在N端90-105位的氨基酸中存在一個與其他蛋白相互作用的結構域。對VP23的突變分析也表明，VP23的C端與三聯體的結構活性直接相關，去除其C端10個氨基酸，即可使其結構活性喪失；而在去除N端71個氨基酸時，才可看到其對三聯體結構活性的影響。

在研究三聯體結構形成的同時，主要殼體蛋白VP5與折疊蛋白pre-VP22a的相互關系以及二者與三聯體蛋白的關系也得以認識。體外蛋白裝配體系和相關方法，如密度梯度離心等，均提示VP5可以先和pre-VP22a相互作用。這一相互作用依賴于VP5與pre-VP22aC端25 個氨基酸所形成特定結構的接觸，從而形成一個VP5和pre22a復合體；而隨著這個結合，pre-VP22a折疊結構舒展開來并以一個機理未知的動力學過程將上述25個氨基酸切下。此時，VP5和pre-VP22a形成的復合物將作為衣殼微粒的主要結構，但是，該復合物還需與VP19c-VP23三聯體復合物結合，形成一個半弧狀的結構體，通常稱作核衣殼體部分結構單位（partial capsid），多個這樣的結構進一步聚合形成核衣殼前體（procapsid）。之后，核衣殼前體結構中的pre-VP22a經病毒絲氨酸蛋白酶的酶解清除，則該核衣殼前體進一步成熟為核衣殼體。這一過程在病毒感染的細胞中基本得到了證實，而且，細胞內的熒光定位分析進一步確認，VP5與pre-VP22a的相互作用以及VP19c與VP23形成三聯體的過程均發生于細胞質中。之后，兩個復合物蛋白轉移入細胞核，在核內聚集形成核衣殼部分結構單位和核衣殼前體。

事實上，在病毒核衣殼形成之后，病毒接下來的最重要事件就是基因DNA在特定的機制下裝配進入核衣殼。在HSV-1病毒中，它至少涉及7個基因編碼蛋白，分別由UL6、UL15、UL25、UL28、UL32、UL33以及UL17基因編碼。此外，UL12基因編碼的蛋白亦發揮一定的作用，盡管不是絕對必需的，但是這個蛋白的缺失可使病毒的產量降低100~1000倍。分子生物學的分析表明，UL12基因編碼的蛋白屬于堿性磷酸酶，雖然其不直接在病毒基因DNA的包裝中發揮，但也（間接）參與了DNA的包裝過程。

另外，其他幾個蛋白均直接參與DNA的酶切與包裝作用。例如，突變體實驗表明，UL25編碼蛋白的作用似乎是將病毒基因組DNA固定于核衣殼體內，其他幾個蛋白則同時作為核衣殼體的結構成分，同時也作為DNA的包裝功能發揮作用。但它們在不同形式的核衣殼體中的存在又有所不同，如UL6、UL17、UL15和UL25這4個基因編碼蛋白都可以在A、B、C三種核衣殼形式以及成熟核衣殼體中存在。這似乎意味著它們在作為核衣殼結構成分的同時也發揮DNA包裝及酶切的功能。更有意思的是，UL17基因編碼產物對于病毒基因組DNA進入核衣殼前體是不可缺少的結構，因此，它也同時存在于三種形式的核衣殼以及成熟的病毒顆粒中。這些現象表明，它既是一種次要的核衣殼結構蛋白，也以病毒的皮層蛋白形式存在，而且它在成熟病毒顆粒中的數量大約是C型核衣殼形式中的兩倍。UL6編碼的蛋白也是一種次要的核衣殼蛋白，不過，它在DNA包裝過程中可以形成核衣殼結構上的DNA入口（Portal）。從核衣殼的結構看，每一個形成的核衣殼均具有一個環指形式的入口。該入口位于核衣殼體的軸線上，是12個垂直面上的一個中心位置結構，由12個UL6基因編碼蛋白組成。其組裝過程的啟動（initiation step）其實是在部分核衣殼體形成過程中開始的，并隨著核衣殼前體的形成而組裝進入核衣殼結構的特定位置。

第九章：完美綻放（病毒出核膜和釋放）

核衣殼在細胞核內裝配完成后，病毒首先要從細胞核逸出至細胞質。在這個過程中，它要穿過核膜并經歷第一次外膜包裹。當到達細胞質后，病毒需要去除第一次包裹形成的外膜，并完成皮層蛋白層化（tegumentation），使得核衣殼外形成一層皮層蛋白。然后，病毒再次穿越細胞質膜，并經歷第二次外膜包裹而逸出細胞，從而形成最終的成熟病毒顆粒。病毒的裝配與逸出過程是我們認識和理解病毒復制周期以及基因功能的重要環節。

當皰疹病毒經過轉錄、DNA復制以及DNA在核衣殼的組裝而形成完整的核衣殼體后，該核衣殼體在細胞核膜的內膜上形成出芽狀態。在這個出芽過程中，核衣殼體就可以獲得來自于細胞核膜的內膜葉。這一過程在HSV-1感染細胞中已得到詳細的分析，而且，其動態過程也得到了細致的資料。

實驗表明，HSV-1核衣殼體在細胞內膜上出芽并獲得第一次的囊膜而進入核周間隙中。事實上，這一過程不是簡單的核衣殼體跨膜運動，有兩個病毒蛋白，即UL31和UL34基因編碼產物參與了該過程。進一步的實驗表明，UL34蛋白是一個Ⅱ型囊膜錨定蛋白，在表達后存在于感染細胞的核膜間隙中；而UL31蛋白則是核磷酸化蛋白，位于感染細胞的核膜上。酵母雙雜交實驗和蛋白質結合實驗表明二者具有物理意義上的相互結合，因此它們可能是以一種相互結合的形式決定它們在膜上的穩定性。突變分析表明，二者之中缺乏任何一個后，核衣殼體逸出核膜的過程都會失敗。在HSV-1感染細胞中觀察到，核衣殼體在逸出核膜過程中可導致該核膜相鄰層狀體的部分損壞。這很明顯地提示，UL34蛋白可通過破壞核膜層狀體結構而為病毒核衣殼體逸出細胞膜提供先決條件。病毒結構的分析表明，逸出核膜、經過第一次囊膜包裹的病毒毒粒表面確實存在UL31和UL34蛋白，但成熟的病毒顆粒上則不含有這兩個蛋白分子。因此，有實驗認為，UL34蛋白屬于病毒核衣殼體第一次囊膜上的蛋白，而UL31蛋白則可能屬于病毒成熟過程中第一次裝配的皮層蛋白。從這個意義看，這兩個蛋白確實可能在核衣殼體逸出核膜過程中以相互作用的方式參與這一過程。這一過程是否涉及其他膜蛋白或皮層蛋白尚不清楚，但可以肯定的是，成熟病毒顆粒囊膜表面存在的糖蛋白，如gB、gC等肯定不參與這一過程。

在上述過程結束后，隨后的事件就有一些細節不太確定了。最近，免疫電鏡實驗證實，核周間隙的病毒顆粒與成熟病毒顆粒在結構上的差異主要表現為，核周間隙的病毒顆粒具有UL31和UL34蛋白，而存在于胞質或是胞外的病毒顆粒則已不具有這兩種蛋白。但是，核周間隙的病毒顆粒所不具有的兩個主要皮層蛋白（UL49和UL46基因編碼）則明顯存在于胞外或是胞質的病毒顆粒中。不過，盡管如此，在這一模型中，核周間隙與核外膜層狀物融合的具體分子機制仍不清楚。【參見綠皮書】

事實上，病毒釋放的過程也是極為復雜的，皮層蛋白和囊膜蛋白在其中都有什么樣的作用呢？我們知道，跟許多其他DNA或RNA病毒明顯不同的是，HSV-1等皰疹病毒具有相當數量的皮層蛋白。那么這些蛋白除了結構上的意義之外，是否還有非結構的功能呢？

最近的實驗表明，這些皮層蛋白之所以被認為是執行基質蛋白的功能，是因為它們既可以與病毒的核衣殼體結構結合，又可與病毒囊膜的糖蛋白的內部尾端相結合，使得它們成為病毒顆粒完整結構的中間部分。盡管如此，長期以來，人們都傾向于把皮層蛋白看做是非結構蛋白。隨著低溫電鏡分析的深入，人們發現至少在HSV-1的結構中，皮層蛋白靠近核衣殼體的最深層部位，也同樣呈現出二十面體對稱形狀。而形成這樣一個結構的原因，是由于一個最大的、約含2000個氨基酸的皮層蛋白——UL36基因編碼蛋白——能夠與核衣殼體直接作用而形成結合體。進一步的蛋白質分析表明，UL36蛋白確實可以與核衣殼蛋白UL19蛋白相互作用而結合，這使得圍繞核衣殼體的第一層皮層蛋白（即UL36蛋白）在形狀上呈現出二十面體的結構。在此基礎上，如果在病毒中利用突變技術敲除另一皮層蛋白UL37基因，則病毒核衣殼體就會停留聚集于細胞質內而不會形成成熟顆粒。這些聚集的核衣殼體不會發生直接的相互作用，但是可以以突出的蛋白膜狀結構相互接觸。有學者認為，這種膜狀物的結合，實際上就是由UL36蛋白介導的。在UL37基因突變的情況下，它們因為失去局部位置的限制而出現變構。由此推斷，固定UL36蛋白以保持其特定二十面體結構的就是UL37蛋白。因此，可以認為，皮層蛋白的第二層就是UL37蛋白。有意思的是，UL36和UL37蛋白差不多在所有人類皰疹病毒中都具有明顯的保守性。

但是，一些病毒形態學的初步分析似乎提示，某些皮層蛋白的缺失，好像并不具有特別重要的意義。例如，UL13、Us3、UL41、UL46、UL47、UL49基因的缺失似乎并不影響病毒成熟顆粒的形成。但是，當敲除UL48（即VP16）基因時，病毒顆粒在細胞質的成熟受到明顯干擾，這表明VP16 是皮層蛋白層中的重要成分。進一步的分析表明，VP16可以和其他皮層蛋白，如UL49（VP22蛋白）相互作用。另外，還可以與UL41（VHS蛋白）相互作用，而此作用對病毒的發育成熟有明顯的影響，因為對VHS基因缺失的突變分析表明，當VHS基因突變足以影響其與VP16的結合時，VHS就無法被裝配進入HSV-1毒粒之中，而完整的病毒顆粒就難以形成。另外，VP16還能夠和UL46、UL47編碼的VP11/12、VP13/14以及糖蛋白具有相互作用。雖然這些作用的機理及直接結果尚不明確，但至少可以提示，VP16對病毒間質化的過程和布局具有十分重要的作用。這樣一個在病毒結構和成熟裝配中具有重要意義，又在病毒基因轉錄激活中具有重要作用的雙層功能蛋白，確實具有很大的研究價值。根據現有資料，目前皮層蛋白包括，UL4、UL11、UL13、UL14、UL21、UL36、UL37、UL41、UL46、UL48、UL49、UL51、UL56、ICP0、ICP4、Us3、Us10、Us11。我們看到，這些蛋白均大多具有非結構功能，因此，我們可以推斷，皮層蛋白的功能還很值得我們去探究。

但是，在整個釋放過程中，囊膜蛋白才是真正的主角。根據現有資料，囊膜蛋白包括UL1、UL10、UL20、UL22、UL27、UL43、UL44、UL45、UL49.5、UL53、Us5、Us6、Us7、Us8和Us9等，這些蛋白在病毒入侵宿主細胞過程中扮演重要的角色。接下來，我們介紹這些囊膜蛋白的形成。

在病毒完成間質化之后，其成熟過程的下一步就是第二次囊膜裝配。從形態學上看，這次囊膜蛋白的裝配是由處于細胞質的核衣殼體經過在細胞質中的囊泡膜上的芽生過程而形成一個完整的病毒顆粒。而后，包裹這個病毒顆粒的囊泡再與細胞質膜融合，將包含在其中的成熟病毒顆粒釋放出細胞。

盡管形態學分析已經清晰地揭示HSV-1病毒成熟的第二次囊膜裝配過程，但有關這一生物學事件的分子機理仍不清楚。不過，一些關于HSV-1病毒囊膜糖蛋白的突變分析提示，這次囊膜裝配的過程似乎與這些囊膜糖蛋白相關。就一般的遺傳學意義上看，位于囊膜的HSV-1編碼糖蛋白對病毒的復制與增殖似乎無直接的必要聯系，但當病毒缺失糖蛋白gE、gI和gM時，則病毒在敏感細胞中的噬斑形成將受到明顯抑制。因此，gE、gI和gM對病毒的第二次囊膜裝配具有非常重要的作用。而且，發揮這一作用的可能就是這些糖蛋白的尾部，因為有實驗表明，當在上述突變體中的糖蛋白gD的跨膜區融合入gE的尾部時，則能夠在一定程度上改變上述突變體的表型。此外，在在第二次囊膜裝配的過程中，病毒囊膜糖蛋白在囊泡上的排列具有嚴格的方向性以確保糖蛋白的尾部均與間質化的核衣殼體結合。酵母雙雜交實驗確證，糖蛋白，如gE蛋白、gM蛋白的尾部與UL49蛋白有特異的相互作用。從這個意義上看，UL49蛋白也應該在病毒的第二次囊膜裝配過程中具有重要的意義。但有意思的是，在一些皰疹病毒增殖及毒粒形成過程中，如UL49蛋白并非絕對需要。但在VZV中，該產物又是十分重要的；同時，HSV-1的gE和gI基因的缺失則會使細胞的裝配受阻。從這些資料看，我們可以初步明確的是，細胞質內的核衣殼體與UL36蛋白之間的相互作用，以及UL49蛋白與gE、gI和gM之間的相互作用。

當然，也許其他未知蛋白之間的相互作用，是促進病毒第二次囊膜裝配的主動原因。有實驗觀察很清楚地證明，在去除了UL37基因的病毒感染的細胞中，金標抗體檢測證實UL49蛋白細胞質內的質膜上，而囊膜在聚集的核衣殼體內被發現。還有實驗表明，gE蛋白，尤其是gE的膜內結構域與HSV-1在組織培養中的極性細胞和神經細胞之間的傳遞過程有明顯關系。這可能是由于gE/gI復合物通常結合于細胞-細胞之間的結合部所致。當然，有推論認為，這可能是gE/gI引導間質化的核衣殼體通過特定囊泡膜部位形成出芽的原因。總的來說，在已間質化的核衣殼體進行第二次囊膜裝配的過程中，還有許多未知的機理有待于了解。但是，大體過程我們是可以知道的。

第十章：病毒復制的整個周期

HSV在進入細胞的過程中，通過膜蛋白和多個細胞受體、輔助受體的結合以完成其介導病毒囊膜與細胞膜融合并使病毒進入細胞的任務。現有模型認為，HSV在吸附細胞膜表面時，先是糖蛋白gC和/或gB與細胞表面的硫酸乙酰肝素黏蛋白（HSPG）非特異性結合，這種結合使得病毒囊膜與細胞膜的空間距離縮短。隨后，gD與胞膜上的特異性受體結合，后者可能為HVEM（herpes virusentry mediator，腫瘤壞死因子家族成員），或是nectin-1和nectin2（免疫球蛋白超家族成員），還可能是由3-O-磺基轉移酶催化硫酸肝素黏分子而產生的異構體（3-OST-3）。這些結合進一步啟動gH、gL，可能還有gK等，與上述蛋白一起，發揮促進介導病毒囊膜與細胞膜融合的作用。

進入細胞后，HSV-1在細胞內向核區域移動，這個過程與微管系統密切相關。首先，進入細胞的HSV-1核衣殼與微管的相關動力蛋白相結合；隨后，即循微管網絡移向細胞核；在到達核膜時，HSV-1核衣殼則似乎是將所含有的基因組DNA注入細胞核內。

病毒基因組入核后，基因組DNA靶向定位于PML小體。事實上，PML小體具有抗病毒作用，然而病毒的皮層蛋白ICP0 具有E3泛素酶作用，可以破壞PML的結構，釋放出病毒可以用于復制的細胞因子（不清楚具體因子是什么）。實驗證明，感染細胞的病毒線性DNA很快形成環狀的復制中間體。隨后，病毒有可能同時以δ復制和θ復制的方式開始DNA復制過程（具體的復制過程咱們后面會說），從而完成病毒基因組DNA的復制。

當病毒基因DNA分子進入細胞核后，將出現一個由宿主細胞RNA聚合酶Ⅱ復合體介導，并由病毒皮層蛋白VP16啟動的轉錄啟動事件。這一事件涉一些胞內蛋白分子，如Oct-1、HCF等，這些細胞蛋白與病毒蛋白形成的聚合體多蛋白復合物，將結合至皰疹病毒基因組中α基因的啟動子區域，以順式激活的方式啟動5個α基因產物（以HSV-1為例），即ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47的轉錄，從而啟動病毒基因組線性轉錄過程。隨后，β基因產物開始產生（病毒DNA復制相關酶均為β基因產物），病毒基因DNA分子也開始復制。當γ基因產物（多為結構蛋白）也順序被轉錄并翻譯形成后，復制完整的基因分子即可作為子代病毒的基因組用于新病毒的裝配合成了。

首先合成的ICP0分子通常出現在細胞核內或核結構附近的位置，這些位置相對應的結構點就是ND10。其主要組成成分即為早幼粒細胞白血病蛋白體（PML），而PML又可結合其他在染色體構象調控（如組蛋白乙酰化、去乙酰化）中起作用的蛋白，如Daxx、CBP、sp100等。這些蛋白在與PML結合的過程中可以呈現天然構象或是小分子泛素化修飾的狀態。很明顯，ICP0在這些部位的聚集及與相關分子的相互作用，提示其可能影響細胞內某些與染色體基因轉錄相關的調控因子。隨著感染細胞內ICP0量的增加，其可逐漸在細胞核內彌散并充滿整個細胞核。感染后期，尤其是病毒基因組DNA合成已經完畢后，該蛋白則可在細胞質內檢出，這一現象事實上是ICP0通過某種尚未確定的機制（可能是與細胞周期蛋白D3）由細胞核移至細胞質導致的。還有報道認為，ICP0從細胞核移向細胞質的擴散過程中，同時促進了ND10結構的解聚及其組分，如PML、sp100等的降解。（有利于病毒復制）

在ICP0發揮轉錄激活作用的同時，ICP4對α-0與α-4基因的轉錄激活則呈現抑制作用。也有實驗認為，這是由于ICP4與轉錄起始復合物的成分TFⅡB結合而導致的。盡管這些資料均未得到統一的結論，但是ICP4作為一種α基因的產物，表現出對早期和晚期基因的轉錄激活和對α基因的轉錄抑制，本身就提示α基因產物對β基因和γ基因轉錄的調控作用。

與ICP0（降解PML以釋放轉錄成分）和ICP4（雙重轉錄調控）不同，HSV-1的ICP27的存在主要是使病毒早期基因和晚期基因的轉錄本（mRNA水平）在感染細胞中聚集以保證病毒的復制，而將其基因敲除后的突變病毒將無法在感染細胞中實現正常的生長增殖。

HSV編碼的ICP47蛋白位于細胞質，它能阻斷細胞內的MHCⅠ類分子在內質網及其他細胞器間的轉運和成熟。目前機制認為，ICP47作用靶點為TAP1/TAP2復合物。在與ICP47結合后，TAP1/TAP2復合物失去裝運蛋白多肽以及結合MHCⅠ類分子的能力。其結果不僅使MHCⅠ類分子結合及呈遞抗原多肽的途徑受到阻礙，同時還能使未與抗原多頭結合的空MHCⅠ類分子迅速降解。在此過程中，可以看到ICP47的特定能力使得HSV感染所可能誘導的免疫反應效率明顯受到影響。這一作用為HSV-1感染贏得一定的時間，使其免受免疫系統的攻擊。

作為即刻早期蛋白，ICP22也是一個根據不同環境而表現不同功能的調控因子（轉錄水平）。有報道認為，ICP22可以促進HSV晚期蛋白（γ2）的表達，這似乎是一種正調控作用。但也有實驗表明，ICP22可以表現出對多種啟動子結構，包括HSV的α、β、γ基因啟動子和某些細胞啟動子的轉錄抑制作用。但是，ICP22的抑制...