神經(jīng)環(huán)路應(yīng)用（36）丨RNA干擾技術(shù)應(yīng)用案例簡介

RNA干擾（RNA interference, RNAi）是一種高度特異性的基因沉默技術(shù)，通過降解靶基因的mRNA，從而在轉(zhuǎn)錄后水平抑制其表達。RNAi已成為神經(jīng)科學、發(fā)育生物學、藥物研發(fā)等領(lǐng)域不可或缺的研究工具。

原理

小干擾RNA（siRNA）：外源導入的雙鏈RNA（約21–23 nt），經(jīng)RISC復合體加載后引導靶mRNA切割。

短發(fā)夾RNA（shRNA）：通過病毒或質(zhì)粒載體在細胞內(nèi)表達，經(jīng)Dicer酶加工為siRNA，實現(xiàn)長期穩(wěn)定沉默。

在神經(jīng)環(huán)路研究中的應(yīng)用

1. 靶向特定腦區(qū)或細胞類型的基因敲低

將攜帶shRNA的AAV病毒注射到目標腦區(qū)，實現(xiàn)局部基因沉默。

結(jié)合細胞類型特異性啟動子實現(xiàn)細胞選擇性敲低。

2. 與行為學結(jié)合，解析基因功能

案例：驗證VMH神經(jīng)元內(nèi)Cav3.1通道是否介導慢性應(yīng)激-誘發(fā)的簇狀放電并導致焦慮/代謝共病

RNA干擾技術(shù)特異性地敲低腹內(nèi)側(cè)下丘腦（dmVMH）神經(jīng)元中Cav3.1鈣通道的表達，以驗證其在慢性應(yīng)激誘導的焦慮樣行為和能量代謝異常中的關(guān)鍵作用。

實驗步驟

1. RNA干擾靶點與設(shè)計

靶基因：Cav3.1（T型鈣通道的一個亞型）

目標細胞群：dmVMH中的SF-1陽性神經(jīng)元（調(diào)控焦慮與代謝的關(guān)鍵神經(jīng)元亞群）

干擾方式：采用DIO系統(tǒng)構(gòu)建的shRNA干擾載體，實現(xiàn)條件性、細胞特異性地敲低Cav3.1表達。

病毒注射：

在慢性應(yīng)激暴露前，將Cav3.1-shRNA或?qū)φ詹《据d體雙側(cè)微量注射至小鼠dmVMH區(qū)域。

特異性表達：

通過SF-1神經(jīng)元特異性啟動子驅(qū)動shRNA表達，確保只在目標神經(jīng)元中干擾Cav3.1。

驗證效率：

免疫熒光：確認Cav3.1蛋白表達在dmVMH中顯著下降。

qRT-PCR：在組織水平上驗證Cav3.1 mRNA水平下降。

單細胞qPCR：在電生理記錄后收集單個神經(jīng)元，進一步確認Cav3.1表達在簇狀放電神經(jīng)元中顯著升高，而RNAi后表達下降。

功能驗證

電生理記錄：

在對照組中，慢性應(yīng)激小鼠約50%的dmVMH神經(jīng)元出現(xiàn)簇狀放電。

在Cav3.1-shRNA組中，僅約18%的神經(jīng)元出現(xiàn)簇狀放電，表明Cav3.1的RNAi顯著抑制了神經(jīng)元的過度興奮性。

鈣信號成像：

在體鈣信號記錄顯示，Cav3.1敲低后，SF-1神經(jīng)元的自發(fā)鈣活動顯著下降，進一步支持其在調(diào)控神經(jīng)元活性中的作用。

行為與代謝表型

焦慮樣行為：

Cav3.1敲低小鼠在高架十字迷宮和曠場測試中表現(xiàn)出焦慮樣行為顯著緩解。

能量代謝：

食物攝入增加，能量消耗趨于正常，代謝紊亂得到改善。

Fig1 AAV-DIO-shRNA 敲低 dmVMH 中Cav3.1對焦慮行為、代謝的逆轉(zhuǎn)效果

RNA干擾的意義

因果驗證：RNAi技術(shù)幫助明確了Cav3.1在慢性應(yīng)激誘導的神經(jīng)元簇狀放電中的因果性作用。

總結(jié)

RNA干擾是一種靈活、高效且可體內(nèi)應(yīng)用的基因功能研究工具，尤其適合在復雜神經(jīng)環(huán)路中進行局部、細胞類型特異性的功能缺失。盡管CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)興起，RNAi因其可逆性、劑量可控性和適用于成年動物等優(yōu)勢仍在神經(jīng)環(huán)路機制研究中占據(jù)重要地位。

文獻引用：

• Shao J, Gao DS, Liu YH, Chen SP, Liu N, Zhang L, Zhou XY, Xiao Q, Wang LP, Hu HL, Yang F. Cav3.1-driven bursting firing in ventromedial hypothalamic neurons exerts dual control of anxiety-like behavior and energy expenditure. Mol Psychiatry. 2022 Jun;27(6):2901-2913. doi: 10.1038/s41380-022-01513-x. Epub 2022 Mar 22. PMID: 35318460; PMCID: PMC9156408.

• Beverly L. Davidson, Ryan L. Boudreau,RNA Interference: A Tool for Querying Nervous System Function and an Emerging Therapy,Neuron,Volume 53, Issue 6,2007,Pages 781-788,ISSN 0896-6273, https://doi.org/10.1016/j.neuron.2007.02.020.

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