漸凍癥的新線索！科學家揭示C9orf72缺失通過免疫失調影響外周神經肌肉系統加速ALS機制

2025年11月15日，馬里奧·內格里藥理學研究所IRCCS Caterina Bendotti研究團隊在《Journal of Neuroinflammation》期刊發表：Loss of C9orf72 impacts the peripheral neuromuscular system via immune dysregulation and accelerates the progression of amyotrophic lateral sclerosis in SOD-1 mutant mice，揭示了C9orf72缺失通過免疫失調影響外周神經肌肉系統并加速SOD1突變小鼠的肌萎縮側索硬化癥進展。

肌萎縮側索硬化癥（ALS）是一種進行性神經退行性疾病，其中神經肌肉系統的完整性對疾病進程至關重要。C9orf72基因突變是ALS最常見的遺傳病因也可導致額顳葉癡呆（FTD），但其在外周神經系統（PNS）中的作用尚不清楚。本研究發現，C9orf72在坐骨神經的運動神經元、小膠質細胞、少突膠質細胞和施萬細胞中表達，但不在星形膠質細胞中表達。C9orf72缺失小鼠雖未出現脊髓運動神經元丟失卻表現出坐骨神經髓鞘形成不足、軸突分選缺陷及神經肌肉接頭（NMJ）去神經支配加重，后者伴隨乙酰膽堿受體γ亞基（AChRγ）表達升高。此外，C9orf72缺失引發外周免疫失調，包括CD8? T細胞相關基因上調和施萬細胞中MHCI表達增加。當C9orf72缺失與SOD1??3?突變共存時，小鼠疾病進展更快、表型更嚴重，但脊髓運動神經元丟失程度并未加劇，提示C9orf72在外周通過影響髓鞘、軸突穩定性和免疫微環境加速ALS病理，而非直接導致中樞運動神經元死亡。

圖一 C9orf72在神經肌肉系統中的表達與細胞分布

首先將C9?/?小鼠與同齡野生型（C9?/?）小鼠在22周齡前進行了體重比較。

結果：

C9?/?小鼠在18至22周齡期間體重顯著高于C9?/?小鼠。然而，在倒置網格上的前肢和后肢抓握耐力以及轉棒實驗表現方面未觀察到差異，表明不存在功能性神經肌肉缺陷。與既往研究一致，C9?/?小鼠在22周齡出現脾腫大。使用C9orf72抗體（GTX634482）發現：C9orf72在運動神經元、小膠質細胞、少突膠質細胞和施萬細胞中表達，但不在星形膠質細胞中；在坐骨神經中主要定位于施萬細胞，在神經肌肉接頭處部分與BTX重疊，提示存在于終末施萬細胞。盡管C9?/?小鼠在mRNA和蛋白水平確認缺失C9orf72，其肌纖維仍顯示免疫染色信號。免疫印跡顯示，脊髓和坐骨神經中僅見55 kDa條帶（敲除后消失），而骨骼肌中存在55 kDa和更豐富的25 kDa兩種亞型，提示組織特異性剪接或翻譯后修飾。

圖二 C9orf72缺失導致骨骼肌去神經支配，但不引起運動神經元丟失

C9orf72缺失不影響腰段脊髓中運動神經元的數量，也不改變星形膠質細胞和小膠質細胞的反應性，然而，與野生型小鼠相比，C9?/?小鼠的骨骼肌中神經支配的神經肌肉接頭（NMJ）數量出現部分但顯著的減少，這與脛骨前肌和腓腸肌中乙酰膽堿受體γ亞基（AChRγ）mRNA水平升高一致，該分子是NMJ去神經支配的標志物。鑒于22周齡C9?/?小鼠在無運動神經元丟失的情況下已出現明顯的NMJ去神經支配，作者進一步檢測了其坐骨神經的形態學和生化特征，并與野生型對照小鼠進行比較。對成年C9?/?小鼠坐骨神經半薄切片的分析未發現明顯病理改變，包括有髓神經纖維密度、軸突變性或髓鞘損傷（如脫髓鞘或慢性再髓鞘化）。然而，電子顯微鏡觀察顯示，與對照組相比，C9?/?小鼠存在大量髓鞘較薄的神經纖維，提示髓鞘形成不足。G比值分析進一步證實了C9?/?小鼠存在髓鞘發育不良：其G比值顯著高于對照組，表明髓鞘厚度相對不足。

圖三 C9orf72缺失損害施萬細胞的髓鞘形成并在坐骨神經中誘導非髓鞘型施萬細胞活化

接下來，作者通過坐骨神經裂解物的Western blot分析，探究C9?/?成年小鼠中觀察到的髓鞘形成不足是否伴隨分子水平的變化。

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結果：

與野生型小鼠相比，C9?/?小鼠坐骨神經中髓鞘堿性蛋白（MBP）和由施萬細胞產生的髓鞘相關酶CNPase的蛋白水平顯著降低。與此同時，非髓鞘型施萬細胞標志物GFAP的表達在C9?/?小鼠坐骨神經中顯著升高。這一結果進一步得到了免疫組織化學的支持：C9?/?小鼠坐骨神經中GFAP陽性細胞數量明顯增多，提示非髓鞘型施萬細胞被激活。有趣的是，GFAP在坐骨神經中與GAP-43部分共定位。盡管GAP-43也表達于再生中的軸突，但在此背景下，其表達可能同時反映軸突變化以及施萬細胞前體或非髓鞘型施萬細胞的存在。因此，雖然將這種共定位視為非髓鞘型施萬細胞激活的佐證，但也承認不能排除損傷或重塑引起的軸突GAP-43表達。值得注意的是，軸突標志物NF200的水平未發生變化，表明外周軸突并非主要受損部位。綜上所述，這些發現不僅支持了作者此前通過電鏡觀察到的形態學結果，還從分子層面提供了施萬細胞群體發生改變的證據。

圖四 C9orf72缺失加劇了SOD1G93A小鼠的神經肌肉功能障礙和神經肌肉接頭去神經支配

盡管外周神經系統（PNS）中髓鞘形成過程的改變并未在C9?/?小鼠中引發運動神經元疾病表型，作者進一步探究了C9orf72缺失是否會影響SOD1G93A小鼠的疾病進展和病理特征。將雄性半合子SOD1G93A小鼠與雌性C9?/?小鼠雜交，獲得SOD1G93A/C9?/?雌性后代。盡管SOD1G93AC9?/?與SOD1G93AC9?/?兩組小鼠體重下降程度相似，但SOD1G93AC9?/?小鼠表現出更早的癥狀起始和更快的功能衰退，在轉棒實驗和PaGE測試中均明顯劣于SOD1G93AC9?/?小鼠。

結果：

SMI31免疫染色顯示，SOD1??3?C9?/?小鼠腰段脊髓腹角中積聚磷酸化神經絲的空泡化運動神經元和營養不良軸突呈增多趨勢；Western blot進一步證實磷酸化神經絲/總神經絲比值升高，提示殘余運動神經元軸突運輸受損。脛骨前肌中，SOD1??3?C9?/?小鼠的去神經支配NMJ比例更高，伴隨AChR-γ表達進一步上升。坐骨神經中，軸突應激標志物NF200和β-importin水平升高，而髓鞘蛋白MBP和CNPase不變；GFAP上調反而減弱。電鏡顯示C9缺失加劇了軸突空泡化和線粒體異常，表明C9orf72缺失加重SOD1突變所致的神經肌肉結構損傷。在脊髓中，SOD1??3?C9?/?小鼠表現出更強的膠質反應（GFAP、IBA1、CD68升高）及T細胞浸潤（CD4?/CD8?相關轉錄本增加）。但促炎因子（TNFα、IL-1β、CCL2）未進一步升高，反而抗炎因子IL-10和修復相關基因YM1顯著上調，提示免疫微環境向調節/修復表型偏移。

綜上所述，本研究揭示C9orf72在外周神經肌肉系統中具有關鍵保護作用：其缺失雖不直接殺死運動神經元，卻通過損害施萬細胞、加劇軸突損傷和NMJ去神經支配并改變免疫微環境，顯著加速ALS進展。結果強調ALS是多系統疾病，靶向外周和免疫調控或為C9orf72相關ALS提供新治療策略。

文章來源

https://doi.org/10.1186/s12974-025-03597-y

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