疫苗前沿 | 免疫原性評價方法在微針疫苗中的應用進展

中文摘要

隨著微針技術的快速發展，微針逐漸成為新興的疫苗遞送方式，其具有微創、無痛、自給藥、節省劑量、增強免疫應答等優勢。免疫原性評價對疫苗的研發至關重要，目前尚無對微針疫苗免疫原性評價方法的系統性總結。此文概述了微針疫苗免疫應答的特點，系統梳理和討論了用于評價微針疫苗免疫原性的各種方法及關鍵指標，并對新興免疫原性評價方法在微針疫苗領域的應用進行了探討和展望。

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正文

微針是新興的微創經皮給藥技術，其微小的針狀結構能夠在不刺激神經的情況下穿透皮膚角質層進入更深的組織，并增強各種藥物或疫苗的皮膚滲透率。相比于傳統注射方式，微針具有微創、無痛、自給藥、冷鏈依賴少等優勢，當前已在滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗和核酸疫苗等多種疫苗接種中表現出了良好的免疫效果，成為了疫苗遞送領域的研究熱點。由于疫苗經皮遞送可能改變抗原的呈遞動力學與局部免疫微環境，進而影響微針疫苗誘導的免疫應答模式，因此在微針疫苗的研發中，系統評估微針疫苗的免疫原性至關重要。這不僅是驗證其有效性的核心依據，也是深入了解其作用機制、優化遞送策略的關鍵環節。本文系統梳理和討論免疫原性評價方法在微針疫苗中的應用，以期為相關研究提供方法學參考。

1

微針疫苗概述

皮膚主要由角質層、表皮層和真皮層組成，其中角質層厚10~20 μm；表皮層厚達1 500 μm，含有豐富的APC，如朗格漢斯細胞；真皮層含有豐富的血管、淋巴管、神經末梢和一些APC（如真皮樹突狀細胞、巨噬細胞等）。這些APC被抗原激活后，可以離開感染部位進入淋巴管，并遷移至局部淋巴結以誘導有效和持久的適應性免疫應答。微針疫苗的核心機制為：微針穿刺皮膚角質層后，迅速觸發先天免疫應答；釋放局部炎癥因子，募集并促進中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞浸潤；同時激活皮膚內的APC，使其遷移至引流淋巴結；此類活化的APC高表達共刺激分子，從而顯著增強T細胞/B細胞的活化與適應性免疫應答。微針的長度通常為100~1 500 μm，在穿刺過程中微針貼片可直接將抗原輸送至表皮層或真皮上層，避免接觸真皮中的神經末梢，具有無痛的優勢。微針本身的物理刺激也能在一定程度上起到佐劑作用，增強免疫應答。與傳統的注射疫苗相比，微針疫苗還具有劑量節約效應、能夠誘導強大的黏膜免疫（這對于應對呼吸道/消化道病毒尤為重要）、偏向Th1型的細胞免疫應答及長效免疫記憶等優勢。近年來，微針技術在皮膚貼片接種疫苗方面取得了顯著進展，其中麻疹-風疹疫苗進入Ⅱ期臨床試驗，流感疫苗和腦炎疫苗進入Ⅰ期臨床試驗，還有多種微針疫苗處于臨床前研究階段。不同類型的微針在疫苗及藥物中已得到廣泛應用，其遞送機制存在一定的差異，見表1。

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免疫原性評價方法在微針疫苗中的應用

為全面評估微針疫苗獨特的免疫應答能力，其免疫原性評價方法除了包含傳統疫苗評價方法，還注重抗原遞送效率和針對皮膚的免疫特性的測定。在遞送效率評估方面，研究者主要通過高效液相色譜、BCA法、活體熒光成像等方法定量和定性微針在皮膚中的溶解釋放和遞送過程，這些方法的應用證實了微針疫苗具有精準、高效遞送的優勢。在局部免疫應答評價方面，已有研究主要應用流式細胞術（flow cytometry，FCM）、細胞內細胞因子染色（intracellular cytokine staining，ICS）、酶聯免疫斑點試驗（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）等方法深度剖析皮膚和引流淋巴結的細胞因子水平，反映微針疫苗誘導的初始免疫應答情況。在系統免疫應答評價方面，微針疫苗評價與傳統疫苗評價方法類似，主要包含體液免疫和細胞免疫評價，通過ELISA檢測特異性抗體、病毒中和試驗（virus neutralization test，VNT）檢測中和抗體、FCM檢測T細胞分型等評估免疫應答水平。上述評價方法的綜合應用為微針疫苗的免疫原性提供了證據支持。傳統疫苗與微針疫苗免疫原性評價指標與檢測方法對比見表2。

2.1

抗原遞送效率測定

盡管與肌肉組織相比，皮膚因含有豐富的APC和免疫輔助細胞而被認為是理想的免疫部位，但是相較于傳統疫苗注射的精準遞送抗原劑量，微針疫苗實際遞送劑量則取決于載藥量及遞送率，要求劑量足夠、靶向定位、結構完整。微針疫苗的實際抗原遞送量和遞送效率對評估其免疫效果起關鍵作用。目前，微針疫苗的抗原遞送主要通過定量和定性方式進行評估，常見評估方法見表3。

抗原的高效遞送是引發強大免疫應答的先決條件，在研發微針疫苗時，應根據疫苗類型的特點選擇最佳的評價方法。如Kim等研發了涂覆乙型肝炎亞單位疫苗的微針，經Bradford比色法進行蛋白質定量和ELISA量化負載量，確保了涂層微針的有效抗原遞送量。Wang等在制備猴痘DNA可溶性微針疫苗時，通過高效液相色譜定量分析了微針貼片使用前后DNA濃度。結果顯示，每個貼片含有（18.26±0.69） μg DNA，將其應用于小鼠皮膚后，貼片殘留DNA為（5.7±1.4） μg，遞送效率約70%。最終通過免疫印跡法和免疫熒光證實了目標抗原在體內的有效表達。

此外，單向免疫擴散法是檢測流感微針疫苗抗原含量的標準方法。其他病毒疫苗（如麻疹-風疹疫苗等）、亞單位疫苗（如新型冠狀病毒疫苗、寨卡病毒疫苗）、核酸疫苗（如新型冠狀病毒mRNA疫苗、埃博拉病毒DNA疫苗等）同樣選取了上述2~3種方法綜合測定了抗原遞送效率，且體內免疫原性研究表明，微針疫苗均產生了良好的免疫效果。

2.2

局部免疫應答評價

局部免疫應答評價是證明微針疫苗能夠實現劑量節約效應的關鍵環節，同時通過分析細胞因子和趨化因子譜，可以了解免疫應答的偏向、強度和類型。例如，IFN-γ、IL-2等Th1型細胞因子的升高表明免疫應答偏向細胞免疫，而IL-4、IL-10等Th2型細胞因子的增加則表明免疫應答與體液免疫相關。趨化因子如C-C趨化因子配體3、4、10等能夠反映接種部位免疫細胞的招募情況，其水平的增高是微針疫苗誘導高效免疫應答的關鍵。通過FCM、ICS、Luminex多因子檢測法及免疫熒光染色等方法監測細胞因子和趨化因子水平，可以準確評估微針疫苗誘導的強大的免疫應答。

在1項可溶性微針疫苗免疫誘導機制的研究中，研究人員給小鼠接種微針疫苗24 h后對皮膚組織進行單細胞RNA測序（single-cell RNA sequencing， scRNA-seq），發現約650個基因的表達顯著上調，尤以IL-1β、IL-7最為顯著，反轉錄定量PCR驗證關鍵基因的表達變化和蘇木精-伊紅染色觀察皮膚炎癥反應等結果也證實了這一點。此外，1項動物研究通過基因表達譜分析、蘇木精-伊紅染色和免疫組織化學檢測發現，微針貼片通過調控局部細胞因子和趨化因子網絡，促進了APC向引流淋巴結的遷移，從而增強了機體免疫應答。

采用ELISPOT、FCM、ICS等檢測技術獲得的大量數據表明，多數抗病毒微針疫苗可誘導IL-1β、IFN-γ等Th1型細胞因子水平顯著升高，提示其傾向于激發強大的細胞免疫應答，這對抗病毒免疫至關重要。

2.3

體液免疫應答評價

體液免疫應答的核心評價指標一般包括特異性抗體滴度、中和抗體滴度、抗體親和力等。

2.3.1　抗原特異性抗體檢測抗原特異性抗體的數量能夠反映疫苗誘導的體液免疫應答的水平。當前，研究人員多采用ELISA檢測抗原特異性抗體。Wen等研發了脂質體負載的可溶性微針乙型肝炎疫苗貼片，通過ELISA定量檢測小鼠血清中抗HBV表面抗原 IgG水平。結果顯示，在所有時間點，較高劑量的可溶性微針皮內給藥均誘導了高水平抗HBV表面抗原滴度，0.1~2.0 μg范圍內的免疫效果呈劑量依賴性。

傳統疫苗因接種途徑多在肌內或皮下而無法誘導有效的黏膜免疫應答，微針疫苗經皮或黏膜遞送，不僅能激活全身免疫應答，還能激活局部黏膜免疫應答。根據病原體的傳播方式不同，在評價時有些研究也檢測IgA抗體滴度。Li等研發了新型冠狀病毒DNA微針疫苗，通過ELISA檢測了接種小鼠血清中新型冠狀病毒刺突特異性抗體（IgG、IgA、IgG1和IgG2c）滴度以及核衣殼特異性IgG抗體滴度。結果顯示，在免疫后第3、6周，微針組不僅誘導了與肌內注射組相當的刺突/核衣殼特異性IgG抗體滴度，而且誘導了顯著高于肌內注射組的刺突特異性分泌型IgA抗體水平，這表明微針疫苗不僅誘導了與肌內注射組相當的體液免疫應答，而且引發了有效的黏膜免疫應答。多項研究表明，經微針遞送的流感病毒疫苗、新型冠狀病毒疫苗、滅活輪狀病毒疫苗等均誘導了有效的黏膜免疫應答，增強了疫苗對機體的保護作用。

2.3.2　中和抗體檢測病毒中和試驗通常用于檢測機體血清中可有效中和病原體的抗體量。在微針疫苗免疫原性評價中常用的病毒中和試驗類型主要包括假病毒中和試驗、嗜斑減少中和試驗、微量中和試驗等。Fan等通過假病毒中和試驗檢測了針對野生型新型冠狀病毒及其變異株的中和抗體水平，研究結果證實，基于微針遞送的DNA疫苗策略在誘導廣譜中和抗體方面具有顯著優勢，這種優勢為應對病毒變異提供了潛在替代方案。另有研究在對比混合抗原、分區抗原微針疫苗誘導的中和抗體水平時，通過噬斑減少中和試驗發現，2種單價疫苗混合和雙室微針聯合疫苗的中和效果無明顯差異且與肌內注射組相當，這證明了雙室微針陣列能夠避免傳統混合疫苗的免疫干擾問題。此外，1項滅活輪狀病毒微針疫苗研究通過微量中和試驗證實了微針疫苗比肌內注射疫苗更高效地誘導了中和抗體。上述方法與傳統疫苗的評價方法基本一致。未來，研究人員可通過綜合評估病毒中和試驗方法的優缺點，選擇最優評價方法。

2.3.3　抗體親和力檢測抗體親和力是指抗原與抗體結合的強度。常用抗體親和力檢測方法包括硫氰酸胍洗脫ELISA和表面等離子體共振。

研究表明，微針疫苗能夠誘導更高親和力的抗體。Littauer等采用ELISA檢測流感微針貼片疫苗誘導的抗體，通過在血清樣本中添加不同濃度的硫氰酸胍測定抗原與抗體結合的強度。含佐劑的微針疫苗組相比于單獨微針組抗體親和力顯著增加，且高親和力抗體與長期免疫保護呈正相關。硫氰酸胍洗脫ELISA檢測抗體親和力雖然操作簡便且靈敏度較高，但是只能測得相對親和力，無法精確測定其解離常數。利用金屬表面的等離子共振現象能夠實時監測抗原-抗體結合的過程，通過計算可測得解離常數。在1項可溶性微針貼片遞送流感滅活疫苗的Ⅰ期臨床試驗中，研究者使用ProteOn表面等離子體共振生物傳感器在25 ℃監測疫苗接種后血清的穩態平衡結合，分析了抗原-抗體親和力。結果表明，與基線相比，在接種后第28天，微針組觀察到了抗原-抗體親和力的顯著增加。

2.4

細胞免疫應答評價

T細胞亞群的數量及比例、關鍵細胞因子水平等指標的檢測對微針疫苗的設計研發起重要指導作用。

2.4.1　CD4+/CD8+ T細胞分型檢測CD4+ T細胞亞群比例及CD8+ T細胞活化水平能夠反映細胞免疫應答的類型與強度。T細胞分型檢測可驗證微針疫苗能否有效激活CD4+和CD8+ T細胞，并誘導兩者產生協同效應。

與傳統疫苗的檢測方法一致的是，FCM利用T細胞表面特異性標志物可區分CD4?和CD8? T細胞，定量其比例和數量，從而評估微針疫苗誘導的T細胞免疫特征。在1項COVID-19 DNA疫苗可分離微針（separable microneedle，SMN）的研究中，研究人員通過FCM檢測小鼠脾臟細胞發現，與單獨SMN疫苗相比，含佐劑的SMN疫苗誘導了更高水平的IFN-γ+/IL-2+ CD8+效應記憶T細胞；此外，通過FCM結合分析新型冠狀病毒特異性IFN-γ+/IL-2+CD4+ T細胞發現，用含佐劑的SMN接種疫苗可以顯著增加相關T細胞的數量，這說明了免疫刺激劑可能有助于激發體液免疫應答。

2.4.2　細胞因子分泌檢測細胞因子分泌可通過ELISA、ELISPOT、ICS聯合FCM等方法來檢測。

ELISA可用于定量檢測細胞因子含量，ELISPOT可用于定量檢測分泌特定細胞因子的細胞數量。研究表明，與傳統疫苗相比，微針疫苗更優的免疫原性源于其激活了更高比例的多功能T細胞。ELISA和ELISPOT無法很好地評估分泌多種細胞因子的細胞數量。為此，現有研究采用ICS聯合FCM，在單細胞水平上進行細胞表型與功能的多維度分析，以此證明微針疫苗誘導了相比于傳統疫苗更高比例的多功能T細胞。例如，Fan等研究的COVID-19 DNA微針疫苗，通過ICS聯合FCM檢測小鼠引流淋巴結和脾臟，證實了微針組表達IL-2、IFN-γ、TNF-α的T細胞的數量顯著高于肌內注射組和空白對照組。這表明經微針遞送疫苗誘導機體產生了更強的免疫應答。

3

免疫原性評價方法創新進展

對于微針疫苗免疫原性評價，目前使用的技術如ELISA、病毒中和試驗、ELISPOT、FCM等雖可廣泛評估微針疫苗接種后T細胞或體液區室中的反應，但無法精準地評估單個免疫細胞之間的反應差異。

ELISA的最低檢測限受其顯色方法靈敏度的限制，難以精確檢測抗體滴度，需要靈敏度更高、多靶標檢測的抗體檢測方法，如Ella全自動微流控ELISA、化學發光酶免疫測定法（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）。前者已在新型冠狀病毒mRNA疫苗研發中被廣泛應用；后者在檢測低濃度Ig時性能顯著，可用于疫苗接種早期檢測低濃度抗新型冠狀病毒抗體。這些新方法在傳統疫苗中的應用為微針疫苗的免疫原性評價提供了新方向。

近年來，scRNA-seq、質譜細胞術、CLEIA、微流控技術等新興方法的出現，為微針疫苗領域提供了新的評價工具。scRNA-seq可用于表征單細胞轉錄組。研究人員通過對單個細胞RNA進行測序，能夠揭示細胞間的異質性及亞群多樣性。此外，該技術還具備在單細胞水平解析疫苗接種反應機制的優勢。質譜細胞術融合了質譜的精確性、無需補償計算、金屬標簽標記，能夠以單細胞分辨率同時測量多達50個細胞特征，增強了FCM的能力。這種技術已用于鑒定新型流感疫苗特異性CD4+ T細胞亞群。CLEIA憑借其高靈敏度、多靶向性的優勢已用于新型冠狀病毒疫苗早期抗體檢測。微流控技術也是近年來在FCM領域中出現的新興技術。微流控設備根據細胞的物理性質通過機械過濾器對細胞進行無標簽細胞分選，彌補了FCM在時間分辨率上的不足。這些新興技術為傳統疫苗的免疫原性評價開辟了新途徑，有望應用于微針疫苗的免疫原性評價。

4

總結與展望

微針作為創新性的疫苗遞送平臺可以有效激發機體的免疫應答，已得到廣泛驗證。在免疫原性評價方面，針對高質量的免疫應答，目前研究者已經整合了諸如ICS、FCM、CLEIA、scRNA-seq等多項高通量、高靈敏度技術，以在單細胞水平分析免疫細胞的活化、分化和記憶形成。同時，活體成像技術等新興技術為實時、原位觀察抗原遞呈與免疫激活過程提供了新視角，深化了對微針疫苗作用機制的理解。盡管如此，目前有關微針疫苗免疫機制的研究尚不充分，微針疫苗免疫原性尚未有統一且規范的評價體系，多數微針疫苗尚未開展長期臨床研究。未來研究應進一步聚焦于以上幾個方面，微針疫苗才能有望在不久的將來大比例替代傳統疫苗的接種方式，為公共衛生事業做出貢獻。

作者

劉衛華1,2 王可慧2 鄒大陽2 李顯煌2 王彬3 李琳昊2 都星月2 周人輝2 秦日輝2 徐雅晴2 劉威1,2

1中國醫科大學公共衛生學院衛生統計學教研室，沈陽 110122；2解放軍疾病預防控制中心免疫規劃科，北京 100070；3安徽醫科大學公共衛生學院流行病與衛生統計學系，合肥 230032

通信作者：劉威，

Email：liuwei5269@qq.com

引用本文：劉衛華, 王可慧, 鄒大陽, 等. 免疫原性評價方法在微針疫苗中的應用進展 [J]. 國際生物制品學雜志, 2026, 49(2): 127-134.

DOI:10.3760/cma.j.cn311962-20250611-00045

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撰寫| 國際生物制品學雜志

校稿| Gddra編審| Hide / Blue sea

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