Genes & Diseases?| 胡小曉團隊與吳二喜團隊開發核酸適體驅動的SARS-CoV-2 N蛋白超靈敏雙模式檢測平臺

撰文丨廖歡

嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型（SARS-CoV-2）變體由于頻繁突變，其傳染性、傳播性和抗原性不斷變化，呈現出持續進化和多樣化特征，從而增加了診斷與治療的復雜性，亟需開發具有高靈敏度和廣譜突變適應性的檢測平臺。盡管逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）和免疫測定仍被視為金標準，但其對實驗條件和操作環境要求較高。

為了解決這一問題，近期，來自湖南大學的胡小曉副教授的研究團隊，聯合美國貝勒醫學院的Erxi Wu教授，在Genes & Diseases上合作發表了題為Dual-mode aptamer-driven biosensing platform for ultrasensitive and mutation-resilient detection of theSARS-CoV-2nucleocapsid protein的研究論文，報道了一種基于核酸適體,可特異性結合SARS-CoV-2 N蛋白的超靈敏雙模式檢測平臺。這項交叉研究融合了分子生物學技術和納米技術，實現了對SARS-CoV-2核衣殼（N）蛋白及其突變株的超靈敏和突變適應性檢測。

研究團隊通過計算機輔助的X-Aptamer SELEX策略及SPR分析技術篩選獲得核酸適體NP14。研究團隊 通過分子對接、截短和堿基突變實驗，揭示了NP14-N蛋白的相互作用。預測結果表明，NP14主要與N端結構域（NTD）內的關鍵殘基相互作用。此外，在NP14結構方面，其二級結構包含兩個關鍵莖環區域 (P1和P2)。圓二色譜證實，NP14采用B型或發夾狀DNA結構，而非G-四鏈體結構，這有助于其高選擇性和低非特異性結合。

為評估核酸適體NP14的特異性與識別廣譜性，研究團隊將其與以下一系列代表性蛋白分別進行結合實驗：SARS-CoV-2 N蛋白、SARS冠狀病毒N蛋白、人類冠狀病毒HCoV-229E、OC43和HKU1的相關蛋白、SARS-CoV-2受體結合結構域（RBD）、甲胎蛋白（AFP）、白細胞介素-4（IL-4）、牛血清白蛋白（BSA）、流感A和B病毒蛋白（Influenza A、Influenza B）。結果顯示，NP14與SARS-CoV-2 N蛋白結合具有很強的特異性且結合效率最高。在酶聯寡核苷酸檢測中，NP14在寬濃度范圍內能識別SARS-CoV-2的α、β、γ、δ、λ和奧密克戎（BA.1、BA.2、B.1.640和BA.4）變體，證實其具有良好的廣譜識別能力。這些結果表明，NP14是一種具有高度特異性、突變適應性好的探針，能夠高效率地檢測各種SARS-CoV-2變體。

在前期報道中，研究人員已將適體與抗體夾心方法用于小分子或者蛋白檢測具有良好的特異性和較高的靈敏度。因此，本研究團隊也開發了一種雜交酶聯免疫測定法（ELAAA），并將其與標準的雙抗體夾心ELISA進行了比較。雜交ELAAA的檢測限為0.1 ng/mL，而ELISA為0.5 ng/mL。這可能歸因于核酸適體的小尺寸和靈活性，減輕了空間位阻，并且避免了僅用抗體形式觀察到的輕微交叉反應，從而減少非特異性結合背景，提高檢測靈敏度。這些結果驗證了在夾心系統中添加核酸適體-抗體可以提高抗原檢測的靈敏度和特異性。

基于這些進展，該團隊設計了一種多色動態光散射增強雜交酶聯免疫測定法（MD-ELAAA），將等離子體比色法與動態光散射（DLS）相結合，實現了肉眼可視化判讀與定量分析，進一步采用病毒培養物對該平臺進行了一系列評估。它檢測到病毒培養物0.43 TCID50/mL，與標準ELISA相比提高了47倍。該MD ELAAA平臺通過以下三項創新：（1）其非聚集等離子體傳感使用金納米花（AuNFs）和銀沉積化學來提供穩定的多色視覺輸出；（2）其雙顯示模式將快速的肉眼比色信號與光散射強度的精確DLS量化相結合；（3）通過利用NP14的高親和力和突變體適應性，該系統也能實現對突變體的高效識別。通過將可視化檢測與儀器定量分析途徑相結合，該MD ELAAA能夠可靠地檢測出低豐度抗原，兼具即時檢測的簡便性與實驗室級的檢測準確性。

研究團隊通過廣泛的驗證實驗證實了MD ELAAA檢測平臺卓越的分析特性。該平臺的核心優勢在于其檢測結果可通過肉眼識別，并且在0.01-5 ng/mL的動態范圍內對目標物表現出良好的檢測性能。與商業ELISA試劑盒（靈敏度1.4 ng/mL）相比，該MD ELAAA方法的性能優于之前大部分報道的基于核酸適體的檢測方法。

綜上所述，本研究介紹了一種高親和力核酸適體NP14，可選擇性靶向SARS-CoV-2核衣殼蛋白的保守N端結構域（NTD）。將核酸適體NP14整合到結合比色法和動態光散射的雙模式MD ELAAA平臺中，使其靈敏度比傳統ELISA高47倍，并具有強大的變體適應性檢測能力。該研究為新一代高靈敏生物傳感器的開發提供了重要思路，兼顧檢測的簡便性與定量準確性。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.gendis.2025.101943

湖南大學生物學院博士生周舒為文章第一作者，湖南大學生物學院胡小曉副教授和美國貝勒醫學院的Erxi Wu教授為本文的共同通訊作者。該項目由湖南省自然科學基金（No. 2023JJ30124）和重慶市自然科學基金（No. CSTB2022NSCQ-MSX1551），福建省自然科學基金（No. 2023J01247）以及廣東省自然科學基金項目（No. 2024A1515012771）資助。

制版人：十一

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