Adv?Sci丨揭示NUP85是肝纖維化的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子

肝纖維化是慢性肝病向肝硬化、肝癌進(jìn)展的關(guān)鍵病理階段，全球約有 3.3% 的人群存在晚期肝纖維化。然而，臨床上至今尚無(wú)獲批的抗肝纖維化藥物，其背后的分子機(jī)制和有效干預(yù)靶點(diǎn)一直是該領(lǐng)域亟待突破的核心難題。近年來(lái)，靶向肝星狀細(xì)胞（ HSCs ）被認(rèn)為是治療肝纖維化最有前景的方向之一。 但核孔蛋白 NUP85 在這一過(guò)程中究竟扮演什么角色？此前從未被系統(tǒng)研究過(guò)。

近日，安徽醫(yī)科大學(xué) 徐濤教授團(tuán)隊(duì) 聯(lián)合 中科大附屬 第一 醫(yī)院 陳昭琳教授 在 Advanced science 雜志在線發(fā)表題為 NUP85 Mediates Endoplasmic Reticulum Stress through the USP47/ASK1 Signaling Pathway to Regulate the Progression of Liver Fibrosis 的研究論文揭示：NUP85是肝纖維化的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子。此外，研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了靶向活化HSCs的CREKA肽修飾脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)，將NUP85小分子抑制劑MogrosideV精準(zhǔn)遞送至活化的HSCs，實(shí)現(xiàn)了安全、高效的治療效果。

首先，為評(píng)估 NUP85 與肝纖維化進(jìn)展的相關(guān)性，分析了多個(gè) GEO 數(shù)據(jù)集（ GSE55747 、 GSE25097 、 GSE84044 、 GSE15654 ）。結(jié)果顯示，在 CCl ? 誘導(dǎo)的肝纖維化、肝硬化及晚期纖維化（ S2-4 ）患者中， NUP85 表達(dá)均顯著上調(diào)，且肝癌肝硬化患者高于非肝癌肝硬化患者； NUP85 表達(dá)與 ACTA2 、 Col1A1 、 Col3A1 等纖維化標(biāo)志物呈顯著正相關(guān)（ r=0.581 、 0.300 、 0.413 ） 。進(jìn)一步在臨床肝纖維化患者及小鼠模型中進(jìn)行驗(yàn)證， H&E 、 Masson 、天狼猩紅染色證實(shí)了典型的纖維化病理改變，免疫熒光、免疫組化、 Western blotting 及 RT-qPCR 均顯示 NUP85 表達(dá)顯著升高 。在 TGF-β1 激活的 LX-2 細(xì)胞中， NUP85 表達(dá)同樣上調(diào) 。原代細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)表明， NUP85 主要在活化的 HSCs 中選擇性上調(diào)，而在肝細(xì)胞和肝巨噬細(xì)胞中變化不顯著，該現(xiàn)象在 CCl ? 及 BDL 兩種模型中均得到驗(yàn)證 。以上結(jié)果為 NUP85 表達(dá)水平與肝纖維化進(jìn)展之間的顯著相關(guān)性提供了充分證據(jù)。

接下來(lái)， 為探究 NUP85 在肝纖維化中的作用，分別構(gòu)建了肝特異性（ AAV8 介導(dǎo)）和 HSCs 特異性（ AAV2-Lrat 介導(dǎo)） NUP85 敲低小鼠模型。在 CCl ? 及 BDL 兩種肝纖維化模型中，肝特異性敲低 NUP85 可顯著降低血清 ALT 、 AST 、 ALP 水平，減少羥脯氨酸含量，減輕 Masson 及天狼猩紅染色顯示的膠原沉積面積，并下調(diào)纖維化標(biāo)志物 α-SMA 、 Col1A1 、 Col3A1 的 mRNA 及蛋白表達(dá)。 HSCs 特異性敲低 NUP85 同樣改善了上述肝損傷及纖維化指標(biāo) 。為進(jìn)一步驗(yàn)證 NUP85 的促纖維化功能，在 NUP85 敲除小鼠中通過(guò) AAV2-Lrat-oeNUP85 恢復(fù)（過(guò)表達(dá)） NUP85 ，結(jié)果顯示 ALT 、 AST 、 ALP 及羥脯氨酸含量升高，膠原沉積面積擴(kuò)大， α-SMA 、 Col1A1 、 Col3A1 表達(dá)上調(diào)，纖維化程度顯著加劇。以上結(jié)果表明， NUP85 在肝纖維化中發(fā)揮促纖維化作用，且該作用主要依賴于 HSCs 中的 NUP85 。

為探究 NUP85 在 HSCs 活化中的作用，首先確定 TGF-β1 的最佳刺激條件（ 10 ng/mL 處理 24 小時(shí)），此條件下 NUP85 蛋白表達(dá)達(dá)峰值 。隨后驗(yàn)證了 NUP85-siRNA 和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率，確認(rèn)其可有效敲低或上調(diào) NUP85 表達(dá) 。功能實(shí)驗(yàn)表明，在 TGF-β1 誘導(dǎo)的 LX-2 細(xì)胞中，敲低 NUP85 可顯著降低纖維化標(biāo)志物 α-SMA 、 Col1A1 和 Col3A1 的 mRNA 及蛋白水平，而過(guò)表達(dá) NUP85 則上調(diào)這些標(biāo)志物 。在原代小鼠 HSC 中， NUP85 敲低同樣抑制了細(xì)胞自發(fā)活化，表現(xiàn)為上述標(biāo)志物表達(dá)降低。以上結(jié)果表明，敲低 NUP85 可有效抑制 TGF-β1 誘導(dǎo)的 HSCs 活化。

為闡明 NUP85 調(diào)控肝纖維化的分子機(jī)制，對(duì)正常和 NUP85 敲低小鼠肝組織進(jìn)行 RNA-seq ， GO 富集分析顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ ERS ）通路顯著受影響。體內(nèi)外驗(yàn)證表明，在 CCl ? 誘導(dǎo)的小鼠及 TGF-β1 刺激的 LX-2 細(xì)胞中，敲低 NUP85 可顯著降低 ERS 標(biāo)志物（ GRP78 、 ATF4 、 p-IRE1 、 CHOP ）的表達(dá)，而過(guò)表達(dá) NUP85 則升高這些標(biāo)志物水平 。為進(jìn)一步驗(yàn)證 ERS 在 NUP85 調(diào)控肝纖維化中的關(guān)鍵作用，使用 ERS 激活劑衣霉素（ TM ）進(jìn)行回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示， TM 處理可部分逆轉(zhuǎn) NUP85 敲低對(duì) ERS 、肝損傷及膠原沉積的抑制作用，表現(xiàn)為 ERS 標(biāo)志物及纖維化標(biāo)志物（ α-SMA 、 Col1A1 、 Col3A1 ）表達(dá)回升，血清 ALT 、 AST 、 ALP 及羥脯氨酸含量增加， Masson 和天狼猩紅陽(yáng)性面積擴(kuò)大。以上結(jié)果表明， ERS 是 NUP85 調(diào)控肝纖維化進(jìn)程的關(guān)鍵介導(dǎo)因素。

為進(jìn)一步闡明 NUP85 在肝纖維化中的作用，對(duì) RNA-seq 數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析和 KEGG 通路富集分析。結(jié)果顯示，對(duì)照組與 NUP85 敲低組小鼠的基因表達(dá)模式存在顯著差異，其中 MAPK 信號(hào)通路是最顯著改變的通路。體內(nèi)外驗(yàn)證表明，在 CCl ? 誘導(dǎo)的小鼠及 TGF-β1 刺激的 LX-2 細(xì)胞中， NUP85 敲低可抑制 ASK1 、 JNK 、 p38 的磷酸化激活，而 NUP85 過(guò)表達(dá)則增強(qiáng)其磷酸化水平。功能回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，腺病毒介導(dǎo)的 ASK1 過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn) NUP85 敲低對(duì) HSC 活化的抑制效應(yīng)；而 ASK1 特異性抑制劑 GS-4997 則可消除 NUP85 過(guò)表達(dá)驅(qū)動(dòng)的促活化效應(yīng)。此外， NUP85 對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控同樣依賴于 ASK1 信號(hào)通路。以上結(jié)果表明， ASK1 是 NUP85 調(diào)控肝纖維化進(jìn)程的關(guān)鍵下游靶點(diǎn)。

為闡明 NUP85 調(diào)控 ASK1 活性的機(jī)制，檢測(cè)了 ASK1 的泛素化和磷酸化水平。結(jié)果顯示，肝纖維化中 ASK1 的泛素化及磷酸化水平均升高，且 NUP85 可正向調(diào)控二者水平 。使用泛素化抑制劑 TAK-243 可阻斷 NUP85 對(duì) ASK1 的調(diào)控作用，而廣譜激酶抑制劑無(wú)此效應(yīng)，提示 NUP85 通過(guò)泛素修飾影響 ASK1 磷酸化活性 。通過(guò) IP-MS 聯(lián)合 RNA-seq 篩選，結(jié)合免疫共沉淀和免疫熒光驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn) NUP85 與去泛素化酶 USP47 存在直接相互作用，且 NUP85 可正向調(diào)控 USP47 的表達(dá)水平。在 TGF-β1 誘導(dǎo)的 LX-2 細(xì)胞中進(jìn)行 NUP85 與 USP47 的共敲低實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示同時(shí)敲低 USP47 可部分逆轉(zhuǎn) NUP85 敲低對(duì)纖維化標(biāo)志物（ α-SMA 、 Col1A1 、 Col3A1 ）及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物（ GRP78 、 ATF4 、 CHOP 等）的抑制作用。以上結(jié)果表明， NUP85 通過(guò)與 USP47 結(jié)合，調(diào)控肝星狀細(xì)胞活化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展。

為探究 NUP85 通過(guò) USP47 調(diào)控 ASK1 泛素化的機(jī)制，首先驗(yàn)證了 USP47 與 ASK1 的相互作用。免疫熒光和免疫共沉淀顯示，二者在 LX-2 細(xì)胞中共定位且直接結(jié)合 。 USP47 過(guò)表達(dá)未影響 ASK1 的 K48 泛素化，但顯著抑制其 K63 泛素化 。競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)表明， NUP85 與 ASK1 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 USP47 的 C19C 結(jié)構(gòu)域 。通過(guò) LC-MS/MS 鑒定出 ASK1 上四個(gè)潛在泛素化位點(diǎn)（ K454 、 K458 、 K805 、 K1081 ），進(jìn)一步構(gòu)建點(diǎn)突變體進(jìn)行功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn) K805R 突變可阻斷 NUP85 和 USP47 對(duì) ASK1 泛素化水平的調(diào)控，而其他位點(diǎn)突變無(wú)此效應(yīng) 。經(jīng)質(zhì)譜獨(dú)立驗(yàn)證， K805 為 ASK1 的關(guān)鍵泛素化位點(diǎn)。以上結(jié)果表明， NUP85 通過(guò) USP47 介導(dǎo) ASK1 第 805 位賴氨酸的去泛素化修飾。

為進(jìn)一步探究 NUP85 的治療潛力，通過(guò)虛擬篩選和分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物羅漢果苷 V （ MV ）可靶向 NUP85 ， CETSA 驗(yàn)證了其結(jié)合能力 。 10~80 μM 的 MV 對(duì) LX-2 細(xì)胞無(wú)毒性，且呈劑量依賴性抑制 α-SMA 和 Col1A1 表達(dá)。在 CCl ? 誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠中， MV 灌胃處理可降低血清轉(zhuǎn)氨酶水平、減輕膠原沉積、下調(diào)纖維化標(biāo)志物及 ERS 標(biāo)志物 。為提高靶向性，構(gòu)建了 CREKA 肽修飾的 PEG 化脂質(zhì)體包載 MV （ CREKA-Lip/MV ），粒徑約 110 nm ，球形均一，可持續(xù)釋放 。體內(nèi)成像顯示 CREKA 修飾顯著增強(qiáng)脂質(zhì)體在纖維化肝臟中的富集 。與游離 MV 相比， CREKA-Lip/MV 更能有效降低血清 ALT 、 AST 、 ALP 及羥脯氨酸含量，減少膠原沉積，下調(diào) NUP85 及纖維化標(biāo)志物表達(dá) 。體外實(shí)驗(yàn)同樣顯示 CREKA-Lip/MV 較游離 MV 更顯著抑制 LX-2 細(xì)胞活化 。 CCK-8 及主要器官 H&E 染色證實(shí)其生物安全性良好 。以上結(jié)果表明， CREKA-Lip/MV 通過(guò)靶向 HSCs 中的 NUP85 安全有效地緩解肝纖維化。

本研究揭示 了 NUP85 是肝纖維化的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子。 NUP85 在纖維化肝組織中顯著上調(diào)，尤其在活化的 HSCs 中。敲低 NUP85 可減輕 CCl ? 和 BDL 誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化，過(guò)表達(dá)則加劇。機(jī)制上， NUP85 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合去泛素化酶 USP47 ，阻斷其對(duì) ASK1 的 K63 去泛素化，增強(qiáng) ASK1 磷酸化及下游 JNK/p38 信號(hào)，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進(jìn) HSCs 活化。靶向 NUP85 的天然產(chǎn)物羅漢果苷 V （ MV ）可抑制纖維化，而 CREKA 肽修飾的脂質(zhì)體遞送 MV （ CREKA-Lip/MV ）能靶向 活化的 HSCs ，安全高效地緩解肝纖維化。 NUP85-USP47-ASK1 軸是肝纖維化治療的潛在新 方向 。

全文鏈接： https://doi.org/10.1002/advs.202519972

徐濤教授 ， 博導(dǎo)，博士后合作導(dǎo)師 ，發(fā)表論文 160 篇 ，其中 SCI 第一作者 / 通訊作者 80 余篇 ，多篇刊登于中科院 1 區(qū) TOP 期刊。兼任 eGastroenterology 編委，《 Oncologie 》編委 , World Journal of Integrated traditional and western Medicine （ WJIM) 青年編委， Medicine Advances 青年編委，《中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)》雜志青年編委 , 《現(xiàn)代藥物與臨床》雜志青年編委。 課題組因發(fā)展需要，長(zhǎng)期招聘 博士及 博士后科研人員，熱忱歡迎具有 肝臟 和 生物學(xué) 相關(guān)背景，有志于 機(jī)制探索 與藥物研究的青年才俊加入，也歡迎本科生和碩士生報(bào)考本課題組的研究生。

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