JACS | 卞光凱/徐娟/Dickschat合作實現細菌二萜合酶的系統挖掘與結構導向功能互換

萜類化合物是一類 兼具 重要經濟 價值 和生物學 功能 的天然產物 ，其中二萜類化合物以其復雜的環化反應和顯著的生物活性而聞名，植物激素赤霉素、抗癌藥物紫杉醇均為其典型代表。 過去幾十年， 研究人員 主要從植物和真菌中尋找 新穎萜類化合物 靈感，而近年來，細菌作為極具潛力卻 尚 未被充分 挖掘 的萜類生物合成基因寶庫，正逐漸進入科學家的視野。然而，如何從數以 萬 計的候選基因中精準篩選出具有活性的 萜類合 酶，并理解其催化 機制 ，是制約該領域 核心瓶頸。

近日 ， 中國科學院深圳先進技術研究院定量合成生物學全國重點實驗室、合成生物學研究所 卞光凱 團隊聯合華中農業大學 徐娟 課題組和 波恩大學 Jeroen S. Dickschat 課題組，在國際期刊 Journal of the American Chemical Society 上發表了題為Systematic Discovery of Bacterial Diterpene Synthases and Structure-Guided Functional Interconversion of ShHS and CbCS的最新研究成果 。該研究通過系統挖掘細菌二萜合酶，顯著拓展了細菌二萜天然產物的化學空間，并揭示了活性中心微環境對產物骨架分化的決定作用。

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原文鏈接： https://doi.org/10.1021/jacs.6c02649

在本研究中， 研究團隊 首先 構建了基于大規模基因組挖掘與工程酵母異源表達相結合的高通量篩選體系 ，對 313 個候選的細菌 I 型二萜合酶進行了高通量功能篩選。通過一系列篩選，團隊 成功鑒定出 16 個具有 二萜 活性的 萜類 合酶 （系列單萜、倍半萜和二倍半萜合酶功能驗證仍在進行中） ，并表征了 10 種 新 二萜化合物，其中包 含 5 種全新碳骨架 。這一發現大幅擴展了細菌二萜類化合物的結構多樣性和化學空間。

在此基礎上 ，研究人員進一步聚焦來源于 Streptomyces hundungensis 的二萜合酶 ShHS 。通過密度泛函理論計算與精確同位素標記實驗相結合，系統解析了該酶催化 GGPP 環化生成 hundungol A 及 系列 副產物的 完整 反應機制。研究表明，該反應首先通過 GGPP 異構化生成 GLPP ，為 后續 關鍵的 1,11- 環化反應 奠定 構象基礎 ； 隨后經連續環化、氫遷移和甲基遷移過程，形成關鍵 碳 正離子中間體 H 。在后續反應 階段 ，不同的環化路徑和骨架重排決定了最終產物的結構分支，其中包括一次罕見的 1,5- 氫遷移步驟。此外，研究還發現 CbCS 的產物 2 雖 與上述機制具有相同的早期反應步驟，但在中間體 H 處直接被水分子淬滅。

一個關鍵問題隨之出現：是什么決定了 CbCS 和 ShHS 兩個酶在 分支點 H 之后的反應方向？為了回答這一問題，研究人員成功解析了 CbCS 的 晶體 結構 ，同時借助 AlphaFold3 完成了 ShHS 的 結構預測，并將關鍵中間體 H 分別 對接 至 兩個酶的活性中心 開展比對分析 。結構分析 結果 顯示，中間體 H 周圍共有 17 個潛在參與催化的氨基酸殘基，其中 8 個在兩種酶之間存在差異。通過定點突變實驗，研究人員成功實現了 二者 的功能互換： 在 ShHS 中 引入 E193T 和 L196Y 突變 ， 可使其生成 CbCS 的主要產物 ； 而在 CbCS 中引入相應的反向突變 T194E 和 Y197L ， 則能產生 ShHS 的特征 產物。此外，位于活性中心附近的關鍵位點 N76/N81 對反應路徑同樣具有重要調控作用。研究團隊進一步利用這些突變體，分離鑒定出 hundungol C 、 hundungol D 、 chloroflexotol B 和 hundungene C 等 多種 新型 二萜化合物，并通過同位素標記實驗 ， 驗證了 這些化合物具有 共同的早期環化過程 ，以 及后期 的 1,5- 氫遷移機制。

在論文評審過程中，國際同行專家對該研究給予了高度評價。審稿人指出，在當前萜類合酶大規模挖掘研究不斷涌現的背景下，該工作不僅 是對 新酶和 新 產物 的羅列 ，更 重要的是 揭示了決定萜類骨架形成的結構與機理 。 總體而言，該研究通過整合基因組挖掘、合成生物學、結構生物學與 計算化學 等多學科方法，不僅系統拓展了細菌二萜天然產物的化學空間，還揭示了萜類合酶如何通過活性中心精細調控碳正離子級聯重排，并實現不同產物骨架之間的可設計轉換 ， 為理解萜類天然產物多樣性的分子基礎提供了關 鍵線索，也為基于理性設計的天然產物生物合成、新型萜類分子定向創制提供了重要的理論與技術支撐。

中國科學院深圳先進院定量合成生物學全國重點實驗室、合成生物學研究所 卞光凱 研究 員、華中農業大學 徐娟 教授和 波恩大學 Jeroen S. Dickschat 教授為 本文 共同通訊作者 ； 中國科學院深圳先進技術研究院 / 華中農業大學聯合培養 博士生 胡哲輝 和 波恩大學博士 后 Zhiyong Yin 為本文共同第一作者 。 中國科學院深圳先進技術研究院 為第一完成單位 。科隆大學 Bernd Goldfuss 教授、南方醫科大學羅奇副教授為研究提供重要支持。 感謝深圳合成生物研究重大科技基礎設施在自動化萜類合酶挖掘和功能表征方面提供的支持。

原文鏈接：https://doi.org/10.1021/jacs.6c02649

制版人：十一

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