細(xì)胞治療領(lǐng)域新進(jìn)展，普瑞基準(zhǔn)攜手AI實(shí)現(xiàn)生物分析新突破！

近年來(lái)，隨著細(xì)胞與基因治療（CGT）領(lǐng)域的快速發(fā)展，體內(nèi)細(xì)胞治療（in vivo cell therapy）正成為行業(yè)矚目的焦點(diǎn)。與傳統(tǒng)體外改造的細(xì)胞療法相比，體內(nèi)細(xì)胞治療通過(guò)慢病毒、RNA-LNP等遞送系統(tǒng)，直接在患者體內(nèi)“原位改造”細(xì)胞，極大縮短了制備周期、降低了治療成本，為自身免疫病與腫瘤治療帶來(lái)了全新可能。

如上圖所示，2025年9月，《柳葉刀》發(fā)表了基于慢病毒載體的體內(nèi)BCMA CAR-T療法治療多發(fā)性骨髓瘤的臨床研究結(jié)果，同時(shí)《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》發(fā)表全球首項(xiàng)基于mRNA-LNP的體內(nèi)CAR-T治療紅斑狼瘡的人體臨床研究，這兩項(xiàng)重磅研究代表著目前體內(nèi)細(xì)胞治療的兩大技術(shù)策略（慢病毒載體和RNA-LNP）和主流方向，標(biāo)志著該技術(shù)正式從概念走向臨床。值得一提的是，這兩項(xiàng)重磅研究全部是在中國(guó)境內(nèi)主導(dǎo)進(jìn)行的，也代表著中國(guó)醫(yī)藥行業(yè)在體內(nèi)細(xì)胞治療領(lǐng)域已經(jīng)處于國(guó)際領(lǐng)先地位。

同樣是在2025年09月底，Carl H. June教授聯(lián)合一眾細(xì)胞治療領(lǐng)域?qū)＜以凇秐ature review》雜志上發(fā)表“In vivo chimeric antigen receptor (CAR)-T cell therapy”綜述，詳細(xì)闡述了體內(nèi)細(xì)胞治療的現(xiàn)狀和未來(lái)的發(fā)展方向。目前慢病毒載體和RNA-LNP（環(huán)狀RNA和mRNA等）各有優(yōu)缺點(diǎn)、各有擅長(zhǎng)的疾病領(lǐng)域，未來(lái)哪種載體更適合臨床應(yīng)用需要通過(guò)更多的臨床數(shù)據(jù)來(lái)驗(yàn)證。

體內(nèi)細(xì)胞治療臨床試驗(yàn)和IIT中涉及的分析指標(biāo)，除了參考2024年發(fā)布的《細(xì)胞治療產(chǎn)品臨床藥理學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》，還應(yīng)參照基因治療相關(guān)的檢測(cè)范疇。我們將從以下兩個(gè)主流的體內(nèi)細(xì)胞治療方向（慢病毒和RNA-LNP）來(lái)闡述體內(nèi)細(xì)胞治療的生物分析策略。

體內(nèi)（In-vivo）細(xì)胞治療（慢病毒載體）檢測(cè)解決方案

細(xì)胞動(dòng)力學(xué)/藥代動(dòng)力學(xué)（Pharmacokinetics）

體內(nèi)細(xì)胞治療產(chǎn)品的體內(nèi)過(guò)程是影響有效性和安全性的重要因素，應(yīng)根據(jù)具體產(chǎn)品采用適宜的分析方法考察細(xì)胞動(dòng)力學(xué)/藥代動(dòng)力學(xué)特征。慢病毒載體進(jìn)行體內(nèi)細(xì)胞治療，一般表達(dá)效率最高可以達(dá)到30-65%甚至更高一些，且會(huì)持續(xù)長(zhǎng)期表達(dá)。慢病毒載體的體內(nèi)細(xì)胞治療除了進(jìn)行體外細(xì)胞治療常測(cè)的CAR+細(xì)胞濃度檢測(cè)（通常采用流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)）和外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)（通常采用qPCR或dPCR方法檢測(cè)）以外，還需要額外增加對(duì)于病毒顆粒本身的檢測(cè)。常見(jiàn)的慢病毒物理滴度檢測(cè)方法包括P24 ELISA法（檢測(cè)載體樣本中的p24蛋白）、qPCR法測(cè)慢病毒滴度（定量測(cè)定血漿中含基因組的慢病毒顆粒）等常用方法，其他新技術(shù)檢測(cè)病毒顆粒數(shù)，如病毒計(jì)數(shù)儀法、納米顆粒跟蹤分析法、場(chǎng)流分離-多角度激光光散射法等，應(yīng)關(guān)注方法對(duì)待測(cè)病毒類型的適用性。目前qPCR法以慢病毒載體基因組中的保守區(qū)（LTR）為靶標(biāo)，能夠定量、高靈敏、快速的檢測(cè)血漿中的病毒總顆粒數(shù)，是目前常用且比較容易搭建的檢測(cè)方法。

藥效學(xué) (Pharmacodynamics, PD)

體內(nèi)細(xì)胞治療藥效學(xué)的檢測(cè)指標(biāo)，基本上和體外細(xì)胞治療是一致的，也是會(huì)重點(diǎn)關(guān)注生物標(biāo)志物等藥效學(xué)指標(biāo)。如可通過(guò)配體結(jié)合試驗(yàn)（LBA）檢測(cè)IL-6、IFNs、TNFs和IL-2等細(xì)胞因子來(lái)評(píng)價(jià)T細(xì)胞的活化特性。檢測(cè)一些特定蛋白的活性、持續(xù)時(shí)間和變化情況等也可以反映藥效，另外淋巴細(xì)胞亞群分析也可對(duì)細(xì)胞治療產(chǎn)品的有效性提供有意義的數(shù)據(jù)支持。針對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤的體內(nèi)細(xì)胞治療產(chǎn)品，血細(xì)胞的檢測(cè)和監(jiān)控是免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品藥效學(xué)分析的重要內(nèi)容。

免疫原性（Immunogenicity）

慢病毒載體進(jìn)行體內(nèi)細(xì)胞治療，一般認(rèn)為會(huì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染免疫細(xì)胞并整合到人的基因組中，在體內(nèi)可以長(zhǎng)期存活并表達(dá)相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，其外源組分和表達(dá)產(chǎn)物均可能引起免疫反應(yīng)。 因此，建議對(duì)外源組分和表達(dá)產(chǎn)物均進(jìn)行免疫原性檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)。如果有共表達(dá)產(chǎn)物，關(guān)注對(duì)共表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行免疫原性檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)，在能夠獲得scFv/蛋白/抗體和陽(yáng)性對(duì)照抗體的情況下，常見(jiàn)的開(kāi)發(fā)模式是采用橋連法，能夠特異性的檢測(cè)相關(guān)的ADA。

除了和體外細(xì)胞治療一樣的免疫原性以外，當(dāng)慢病毒載體回輸?shù)饺梭w內(nèi)時(shí)，針對(duì)病毒本身也會(huì)產(chǎn)生免疫原性，因此針對(duì)慢病毒本身的免疫原性是體內(nèi)細(xì)胞治療要重點(diǎn)考慮的一個(gè)方向。一般人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的最主要、最有效的靶標(biāo)是病毒顆粒表面的包膜糖蛋白和衣殼蛋白。因此，為了全面的評(píng)估針對(duì)慢病毒本身的免疫原性，有以下圖中幾種開(kāi)發(fā)策略：

1.采用直接法檢測(cè)針對(duì)慢病毒的廣譜ADA：把慢病毒顆粒包被在板底，由于慢病毒本身很難進(jìn)行標(biāo)記（主要是因?yàn)槁《镜蘑俳Y(jié)構(gòu)脆弱性：慢病毒的囊膜對(duì)物理化學(xué)處理敏感，易失活；②靶點(diǎn)稀少與異質(zhì)性：表面可用于共價(jià)標(biāo)記的化學(xué)基團(tuán)（如賴氨酸的氨基）數(shù)量有限且分布不均；③功能敏感性：標(biāo)記反應(yīng)容易損傷其感染性所必需的表面糖蛋白（如VSV-G）），所以用anti-human Fc antibody進(jìn)行檢測(cè)，這種方法的優(yōu)勢(shì)是能夠檢測(cè)到和慢病毒本身結(jié)合的所有抗體ADA，缺點(diǎn)是會(huì)產(chǎn)生較多的背景信號(hào)，特異性不夠好。或者利用抗體提取和酸解原理，采用親和捕獲洗脫法（ACE）來(lái)檢測(cè)針對(duì)慢病毒本身的所有抗體ADA。

目前體內(nèi)CAR-T經(jīng)常會(huì)把慢病毒上的包膜蛋白EnV改造成假型化載體（使用VSV-G），人體內(nèi)產(chǎn)生的抗體主要針對(duì)VSV-G蛋白，則需要針對(duì)VSV-G蛋白去開(kāi)發(fā)方法。另外，p24是構(gòu)成慢病毒粒子衣殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白，每個(gè)病毒顆粒含有約2000個(gè)p24蛋白分子。針對(duì)p24本身的抗體檢測(cè)方法也可以考慮代表慢病毒的免疫原性。

因此直接法的檢測(cè)抗體也可以考慮換成標(biāo)記好的包膜蛋白（VSV-G）或衣殼蛋白（p24），這樣會(huì)減少很多背景信號(hào)。

2.如上文所述，也可以采用針對(duì)包膜蛋白VSV-G和針對(duì)衣殼蛋白p24進(jìn)行ADA檢測(cè)，這兩個(gè)蛋白的ADA目前認(rèn)為在一定程度上也能夠代表針對(duì)慢病毒的免疫原性，優(yōu)勢(shì)是檢測(cè)方法特異性更好，缺點(diǎn)是可能無(wú)法完全表征針對(duì)慢病毒的全部抗體。

3.如下圖所示，目前為了使體內(nèi)細(xì)胞療法更具有靶向性，能夠特異性的轉(zhuǎn)染體內(nèi)的免疫細(xì)胞。一般都會(huì)在慢病毒表面偶聯(lián)一些特異性的抗體，比如CD3、CD4、CD5、CD7、CD8等，人體針對(duì)這些偶聯(lián)抗體可能也會(huì)產(chǎn)生一定的免疫原性，雖然針對(duì)這些免疫標(biāo)記物抗體的免疫原性可能會(huì)極低，建議前期進(jìn)行研究的時(shí)候也可以充分和全面的考慮，避免漏掉一些信息。

安全性檢測(cè)（Safety）

以慢病毒為載體的體內(nèi)細(xì)胞療法和體外細(xì)胞療法，都會(huì)關(guān)注的是：慢病毒載體因其可整合靶細(xì)胞基因組的特性，對(duì)其安全性監(jiān)管的重點(diǎn)主要集中在可復(fù)制性慢病毒與載體插入位點(diǎn)的檢測(cè)。普瑞基準(zhǔn)已經(jīng)自主研發(fā)了一套高效的慢病毒復(fù)制型病毒（RCL）檢測(cè)和慢病毒整合位點(diǎn)（ISA）檢測(cè)方法，如VSV-G QPCR法檢測(cè)包膜基因核酸片段、p24結(jié)構(gòu)蛋白檢測(cè)法，以及NGS平臺(tái)檢測(cè)ISA的方法，目前這些方法都用于注冊(cè)臨床試驗(yàn)中的樣本檢測(cè)。

對(duì)于體內(nèi)細(xì)胞療法，可能還需要額外關(guān)注脫靶風(fēng)險(xiǎn)，比如非T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)可能引發(fā)毒性（如肝毒性），普瑞基準(zhǔn)在脫靶檢測(cè)評(píng)估方面依托公司強(qiáng)大的AI+生信分析能力，為不同的細(xì)胞治療產(chǎn)品提供全面精準(zhǔn)的評(píng)估。

體內(nèi)（In-vivo）細(xì)胞治療（靶向脂質(zhì)納米顆粒（tLNPs））檢測(cè)解決方案

細(xì)胞動(dòng)力學(xué)/藥代動(dòng)力學(xué)（Pharmacokinetics）

靶向脂質(zhì)納米顆粒（tLNPs）的體內(nèi)細(xì)胞治療，除了進(jìn)行體外細(xì)胞治療常測(cè)的CAR+細(xì)胞濃度檢測(cè)和外源基因拷貝數(shù)/mRNA檢測(cè)以外，如果需要額外關(guān)注脂質(zhì)納米顆粒在人體內(nèi)的濃度變化、分布和清除過(guò)程，則需要采用LC-MS/MS等技術(shù)進(jìn)行及時(shí)檢測(cè)。脂質(zhì)納米顆粒的PK特性與傳統(tǒng)藥物不同，主要表現(xiàn)為快速組織分布、緩慢消除和肝/腎清除特征。早期臨床研究階段如需要探索相關(guān)機(jī)制，可以考慮進(jìn)行全面的藥代動(dòng)力學(xué)分析。

靶向脂質(zhì)納米顆粒（tLNPs）的體內(nèi)細(xì)胞治療的表達(dá)效率一般會(huì)比慢病毒載體的低一些，比如遞送物質(zhì)如果是mRNA的話，CAR表達(dá)可能僅能持續(xù)2-3天，目前很多公司也在使用環(huán)狀RNA（cRNA）作為遞送物質(zhì)，CAR表達(dá)能夠延長(zhǎng)至5-10天。RNA-LNP體內(nèi)細(xì)胞治療的愿景是既能獲得持久、高效的蛋白表達(dá)，又無(wú)需永久性改變細(xì)胞基因組。

藥效學(xué) (Pharmacodynamics, PD)

靶向脂質(zhì)納米顆粒（tLNPs）的體內(nèi)細(xì)胞治療的藥效學(xué)檢測(cè)指標(biāo)基本上和上述的慢病毒載體體內(nèi)細(xì)胞治療一樣的，此處不再贅述。

免疫原性（Immunogenicity）

靶向脂質(zhì)納米顆粒（tLNPs）的體內(nèi)細(xì)胞治療，也需要對(duì)外源組分和表達(dá)產(chǎn)物均進(jìn)行免疫原性檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)。開(kāi)發(fā)方法和體外細(xì)胞治療一樣，比如需要針對(duì)scFv進(jìn)行ADA檢測(cè)。

除了和體外細(xì)胞治療一樣的免疫原性以外，由于tLNPs作為載體回輸?shù)饺梭w內(nèi)時(shí)，不會(huì)使mRNA整合到細(xì)胞基因組，而是短暫表達(dá)，因此需要多次給藥，并且為了使表達(dá)效率提高，目前的給藥劑量也較大，所以人體還是會(huì)產(chǎn)生一定的免疫原性。目前常用的LNP載體通常認(rèn)為是免疫原性很低的載體，以LNP本身制備ADA陽(yáng)性對(duì)照（Positive control）比較困難，一般情況下不考察LNP總體的免疫原性。但是值得注意的是LNP上通常有PEG脂質(zhì)，其中的PEG修飾成分是潛在的引起免疫原性的物質(zhì)，并且機(jī)體可能存在預(yù)存anti-PEG抗體（pre-existing anti-PEG antibodies）也會(huì)造成藥物清除速度加快等情況。因此通常對(duì)于LNP載體的mRNA藥物，會(huì)建議考察其PEG成分的免疫原性。針對(duì)脂質(zhì)納米顆粒的PEG2000成分，血液樣本的ADA檢測(cè)應(yīng)該能夠檢測(cè)到IgG和IgM亞型，可以考慮檢測(cè)抗PEG IgM和IgG來(lái)全面考察針對(duì)PEG的ADA。

如下圖所示，和慢病毒載體類似的，目前為了使體內(nèi)細(xì)胞療法更具有靶向性，能夠特異性的轉(zhuǎn)染體內(nèi)的免疫細(xì)胞。一般都會(huì)在LNP表面偶聯(lián)一些特異性的抗體，比如CD3、CD4、CD5、CD7、CD8等，人體針對(duì)這些偶聯(lián)抗體可能也會(huì)產(chǎn)生一定的免疫原性，考慮和檢測(cè)方法和上文慢病毒載體的類似，此處不做進(jìn)一步贅述。

安全性檢測(cè)（Safety）

目前普遍認(rèn)為脂質(zhì)納米顆粒（LNP）的安全性是優(yōu)于慢病毒載體的，主要是mRNA等轉(zhuǎn)染細(xì)胞后是瞬時(shí)表達(dá)，無(wú)插入突變風(fēng)險(xiǎn)。這一技術(shù)在COVID-19疫苗中得到了史無(wú)前例的驗(yàn)證，其高效、安全、可規(guī)?；奶匦?，使其成為in vivo CAR-T領(lǐng)域最具潛力的候選者。

對(duì)于靶向脂質(zhì)納米顆粒（tLNPs）的體內(nèi)細(xì)胞治療，也需要額外關(guān)注脫靶風(fēng)險(xiǎn)，此處是和慢病毒載體比較類似，。

結(jié)語(yǔ)

在目前的體內(nèi)細(xì)胞治療前沿領(lǐng)域，普瑞基準(zhǔn)公司憑借深厚的中心實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)與多組學(xué)技術(shù)積累，為藥企提供從方法開(kāi)發(fā)到臨床檢測(cè)的全流程生物分析解決方案，助力體內(nèi)細(xì)胞治療從實(shí)驗(yàn)室走向患者。然而，這類新型療法的臨床開(kāi)發(fā)離不開(kāi)精準(zhǔn)、合規(guī)的生物分析支持。從藥代動(dòng)力學(xué)到免疫原性，從安全性到生物標(biāo)志物，每一個(gè)環(huán)節(jié)都需嚴(yán)格驗(yàn)證與標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)。普瑞基準(zhǔn)是國(guó)內(nèi)為數(shù)不多擁有雙“C”認(rèn)證（CAP+CLIA）的實(shí)驗(yàn)室，其質(zhì)量體系不僅能夠滿足國(guó)內(nèi)臨床試驗(yàn)對(duì)于中心實(shí)驗(yàn)室的要求，也承接了很多國(guó)際多中心臨床試驗(yàn)（MRCT）項(xiàng)目。

體內(nèi)細(xì)胞治療正在重塑未來(lái)醫(yī)藥的格局。普瑞基準(zhǔn)愿與行業(yè)伙伴攜手，以精準(zhǔn)、可靠、高效的生物分析服務(wù)，共同推動(dòng)更多創(chuàng)新療法早日惠及患者，助力中國(guó)CGT走向世界前沿。

作為一家以“多組學(xué)+數(shù)據(jù)挖掘”為特色的新型平臺(tái)公司，普瑞基準(zhǔn)在細(xì)胞與基因治療領(lǐng)域已積累了豐富的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)。公司在北京與蘇州設(shè)有中心實(shí)驗(yàn)室，配備流式細(xì)胞儀、qPCR/dPCR、MSD、NGS、單細(xì)胞測(cè)序等先進(jìn)平臺(tái)，可為藥企提供符合NMPA/FDA要求的生物分析服務(wù)。

【關(guān)于普瑞基準(zhǔn)】

普瑞基準(zhǔn)是一家以“多組學(xué)+AI”驅(qū)動(dòng)，專注于創(chuàng)新藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研發(fā)服務(wù)的新型平臺(tái)公司。公司為藥企提供全球領(lǐng)先水準(zhǔn)的生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、基于生物標(biāo)志物的新藥臨床差異化開(kāi)發(fā)策略、中心實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、藥物伴隨診斷開(kāi)發(fā)等服務(wù)。目前已與多家國(guó)內(nèi)外領(lǐng)先的藥企及生物科技公司形成深度合作，助力多個(gè)新藥的研發(fā)和獲批。同時(shí)，公司也在臨床端與合作的藥企、醫(yī)生一道為患者提供先進(jìn)、精準(zhǔn)的檢測(cè)產(chǎn)品，助力精準(zhǔn)檢測(cè)的臨床實(shí)踐。（文章來(lái)源于：公眾號(hào)普瑞基準(zhǔn)）

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