蘇州納米所/蘇大ACS Nano：仿生多層導電神經導管為周圍神經長段缺損修復提供新策略

周圍神經損傷是臨床常見問題，常導致嚴重殘疾并造成巨大的社會經濟負擔。由于神經軸突再生緩慢、易發生方向性誤導和突觸錯配，神經的自我再生能力難以實現功能恢復。臨床上，長段神經缺損（超過5毫米）的治療尤為棘手。盡管自體神經移植被視為“金標準”，但其面臨著供區并發癥和尺寸匹配困難等問題。為應對這些挑戰，組織工程領域發展了多種神經引導導管，但現有的人工神經導管普遍存在成分單一、結構簡單以及缺乏仿生結構等局限性。天然神經的多層結構——包括神經外膜、神經束膜和神經內膜——突顯了復合結構對于再現神經結構復雜性的重要性。

近日，中國科學院蘇州納米所程國勝研究員、郝瑩副研究員與蘇州大學趙薈菁教授、肖淼副研究員合作，受天然神經多層結構的啟發，開發了一種結合水凝膠和針織絲纖維套管的仿生多層導電神經引導導管，用于周圍神經再生。該復合導管整合了外層絲素蛋白針織套管以提供機械支撐并模擬神經外膜結構、內層由絲素蛋白和甲基丙烯酰化明膠組成的多通道水凝膠以促進細胞黏附和神經營養因子釋放，并引入聚吡咯實現電活性調控。研究表明，SF/GelMA/Ppy/KS復合導管具有可降解性、導電性、機械穩定性、定向結構，并表現出良好的體外和體內生物相容性。在大鼠坐骨神經長段缺損模型中移植該復合導管，成功實現了神經再生和功能恢復。通過將仿生結構與多功能生物材料相結合，該研究為長段神經再生提供了一種有前景的人工神經導管。相關論文以“Bioinspired Multilayered Conductive Nerve Guidance Conduit Built on Hydrogels and Knitted Silk Fiber Sleeves for Peripheral Nerve Regeneration”為題，發表在

ACS Nano

圖1： 具有人工仿生神經外膜結構的雙網絡導電水凝膠神經導管的復合支架示意圖，將其移植到坐骨神經橫斷部位用于神經修復和再生。

研究團隊首先詳細展示了SF/GelMA/Ppy/KS復合導管的制備過程和多尺度結構特征（圖2）。宏觀照片顯示，長度為10毫米的復合導管結構完整；掃描電鏡觀察揭示了內部的多微通道水凝膠結構，這種設計有助于引導軸突再生并促進周圍神經損傷修復。外層絲素蛋白針織套管在浸涂前纖維較為松散、孔隙不規則，經過絲素蛋白/聚環氧乙烷/甘油浸涂后，絲纖維表現出良好的結構穩定性和規整性，形成了類似于天然坐骨神經外膜膠原纖維網絡的分級互聯纖維結構。力學測試表明，浸涂后的針織套管保持了88.4 ± 0.7 MPa的高斷裂強度，斷裂伸長率約為45%，與天然神經外膜的生理斷裂伸長率相當。值得注意的是，PPy的引入增強了水凝膠的力學和電學性能，SF/GelMA/Ppy水凝膠的壓縮模量較純SF或GelMA水凝膠顯著提高，電導率達到1.1×10?2 ± 1.3×10?3 S/cm，處于天然神經組織的生理電導率范圍內。LED燈泡點亮實驗進一步證實了其導電性。此外，SF/GelMA/Ppy水凝膠表現出232.5 ± 47.1%的溶脹率和適宜的降解特性，與KS復合后溶脹率降低至126.9 ± 16.4%，表明外層KS結構限制了內部水凝膠的溶脹。

圖2： 復合神經導管的制備、表征、掃描電子顯微鏡觀察及性能。（a）SF/GelMA/Ppy/KS導管制備示意圖。（b）SF/GelMA/Ppy/KS導管的照片。（c）SF/GelMA/Ppy水凝膠的橫截面。（d）SF/GelMA/Ppy水凝膠的縱截面。（e）未浸涂針織套管的掃描電鏡圖。（f）浸涂后針織套管的掃描電鏡圖。（g）未浸涂針織套管和浸涂針織套管的拉伸性能。（h）未浸涂針織套管和浸涂針織套管的彈性模量。（i）不同水凝膠的壓縮性能（SF、GelMA、SF/GelMA、SF/GelMA/Ppy水凝膠）。（j）不同水凝膠的壓縮模量。（k）SF/GelMA/Ppy水凝膠的導電性（LED燈）。（l）不同材料的導電性（SF、GelMA、SF/GelMA、SF/GelMA/Ppy、SF/GelMA/Ppy/KS）。（m）不同水凝膠的溶脹性能。（n）不同水凝膠的降解速率。數據為平均值±標準差；Tukey事后檢驗后采用單因素方差統計分析（每組n=3），ns表示無顯著差異，p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001，****p < 0.0001表示顯著性差異。

在體外生物相容性評估中（圖3），研究團隊將施萬細胞接種于不同支架材料上培養。三維共聚焦圖像顯示，施萬細胞在整個神經導管內鋪展和生長，活/死染色證實四種支架上的細胞存活率均超過95%，這主要歸功于SF、GelMA和PPy優異的生物相容性。免疫熒光染色結果顯示，SF/GelMA/Ppy組細胞S100蛋白表達水平顯著高于其他組，這可能歸因于PPy的導電性模擬了神經電生理微環境，激活了與施萬細胞增殖和分化相關的信號通路，促進細胞向成熟施萬細胞分化。四組細胞中GFAP均呈低水平表達，且組間無顯著差異。體內生物相容性實驗將SF/GelMA/Ppy/KS支架植入SD大鼠下肢肌肉，12周后HE和Masson染色未見明顯炎癥反應，肌肉組織長入支架內部，表明該復合支架具有良好的組織相容性。

圖3： 不同支架上施萬細胞的體外培養。（a）施萬細胞接種于神經導管支架的示意圖，包括生長、遷移和延伸突起。（b）培養第3天，FITC和DAPI標記的施萬細胞在SF/GelMA/Ppy支架上生長和分布的三維共聚焦圖像。比例尺：500 μm。（c）活細胞（鈣黃綠素-AM，綠色）和死細胞（碘化丙啶，紅色）的代表性圖像。比例尺：100 μm。（d）來自（c）的細胞活力統計。（e，f）S100和GFAP的代表性免疫熒光圖像。比例尺：200 μm。（g，h）來自（e）和（f）的免疫熒光結果統計。數據為平均值±標準差；Tukey事后檢驗后采用單因素方差統計分析（每組n=3），ns表示無顯著差異，*p < 0.05，**p < 0.01表示顯著性差異。

為評估再生神經的功能恢復情況（圖4），研究團隊測定了復合肌肉動作電位。結果顯示，SF/GelMA/Ppy移植組較橫斷組顯著改善了神經沖動傳導功能，其CMAP振幅（約5 mV）略低于正常對照組（約3 mV），表明SF/GelMA/Ppy能夠在移植后發揮神經沖動傳導作用。通過步態分析評估坐骨神經功能指數，SF/GelMA/Ppy/KS組和自體移植組的SFI評分高于SF/GelMA/Ppy組，且SF/GelMA/Ppy/KS組與自體移植組間無顯著統計學差異。腓腸肌形態分析顯示，所有手術側均出現一定程度的肌肉萎縮，但SF/GelMA/Ppy/KS組和自體移植組的肌肉萎縮程度較輕，腓腸肌濕重恢復率相近，膠原纖維增生較少。這些結果表明，SF/GelMA/Ppy/KS神經導管支架的植入促進了坐骨神經損傷后的功能恢復，KS因其與神經外膜的結構相似性，在支持、保護、營養供應和免疫屏障方面發揮了重要作用。

圖4： 大鼠坐骨神經和腓腸肌的體內形態和功能評估。（a）復合肌肉動作電位信號采集示意圖。（b）該圖描述了當在生物神經末端引入外部電壓偏移時，通過不同類型神經傳遞的電壓如何隨時間演變。（c）CMAP的峰值振幅。（d）12周后模型大鼠的步態分析。比例尺：5 mm。（e）來自（d）的大鼠模型坐骨神經功能指數。（f）12周后分離的模型大鼠腓腸肌。比例尺：1 cm。（g）來自（f）的模型大鼠腓腸肌濕重比統計。（h）手術側腓腸肌橫截面的Masson三色染色代表性圖像。比例尺：100 μm。（i）來自（h）的膠原纖維面積定量分析。數據為平均值±標準差；Tukey事后檢驗后采用單因素方差統計分析（每組n=3），ns表示無顯著差異，p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001，****p < 0.0001表示顯著性差異。

研究團隊進一步對再生神經的組織形態學進行了多模式技術評估（圖5）。術后12周，SF/GelMA/Ppy/KS組再生神經較SF/GelMA/Ppy組更粗。HE染色顯示，SF/GelMA/Ppy/KS組再生神經纖維生長密度更高、再生組織面積更大，表明KS能增強施萬細胞增殖和神經再生能力。甲苯胺藍染色顯示，SF/GelMA/Ppy/KS組施萬細胞數量遠高于SF/GelMA/Ppy組，接近自體移植組。透射電鏡觀察顯示，SF/GelMA/Ppy/KS組有髓軸突直徑（3.2 ± 0.4 μm）和髓鞘厚度（650.7 ± 95.19 nm）均顯著高于SF/GelMA/Ppy組，與自體移植組相近。G-比值（軸突直徑與神經纖維總直徑之比）在SF/GelMA/Ppy/KS組（0.72 ± 0.05）和自體移植組（0.73 ± 0.05）相近，表明SF/GelMA/Ppy/KS組在神經信號傳導功能、形態重建和神經再生方面優于SF/GelMA/Ppy組。

圖5： 通過多模式技術揭示修復后坐骨神經的組織形態學。（a）動物實驗操作流程示意圖。（b）植入后12周再生坐骨神經的照片。比例尺：5 mm。（c）12周后再生神經組織橫切面的HE染色圖像。右側比例尺：50 μm。（d）再生神經縱切面的TB染色圖像。左側比例尺：500 μm，右側比例尺：100 μm。（e）移植后12周再生神經纖維的代表性TEM圖像。左側比例尺：100 μm，右側比例尺：5 μm。（f）來自TB染色的施萬細胞密度定量分析。（g-i）有髓軸突直徑、髓鞘厚度和G-比值的定量分析。數據為平均值±標準差；Tukey事后檢驗后采用單因素方差統計分析（每組n=3），ns表示無顯著差異，p < 0.01，p < 0.001，***p < 0.0001表示顯著性差異。

免疫熒光組織化學分析（圖6）進一步證實了SF/GelMA/Ppy/KS對神經修復再生的促進作用。SF/GelMA/Ppy/KS組中軸突相關蛋白NF200、S100、Tuj-1、GFAP、GAP43、MAP2和NeuN的熒光分布和陽性率均顯著高于SF/GelMA/Ppy組，與自體移植組相似，表明該組再生神經對軸突再生、神經分化和成熟具有積極作用。在髓鞘修復方面，MBP染色顯示SF/GelMA/Ppy/KS組MBP表達增強，髓鞘連續致密。在瘢痕和炎癥調節方面，SF/GelMA/Ppy/KS組相較于SF/GelMA/Ppy組，促炎細胞因子TNF-α表達顯著下調，抗炎細胞因子IL-10表達上調，促瘢痕生物標志物α-SMA、Col-I、TGF-β1表達降低。這些結果表明，KS通過調節局部炎癥微環境抑制瘢痕形成，引導定向和完全的軸突生長，促進髓鞘成熟。

圖6： 術后12周再生坐骨神經的免疫熒光組織學分析。（a-d）NF200、S100、Tuj-1、GFAP、GAP43、MAP2和NeuN的免疫組織化學染色圖像。（e-h）NF200、S100、Tuj-1、GFAP、GAP43、MAP2和NeuN的定量分析。（i-k）MBP（髓鞘修復標志物）、IL-10和TNF-α（炎癥相關標志物）以及α-SMA、Col-I和TGF-β1（瘢痕相關標志物）的免疫組織化學染色圖像。（l-q）MBP、IL-10、TNF-α、α-SMA、Col-I和TGF-β1的定量分析。數據為平均值±標準差；Tukey事后檢驗后采用單因素方差統計分析（每組n=6），ns表示無顯著差異，p < 0.01，p < 0.001，***p < 0.0001表示顯著性差異。

綜上所述，該研究通過結合絲素蛋白針織套管和多微通道SF/GelMA/Ppy水凝膠，成功構建了一種仿生復合神經引導導管，以應對長段周圍神經缺損修復的關鍵挑戰。其分層結構模擬了天然神經的機械支持和電活性微環境，而SF/GelMA基質構建了生物活性ECM模擬微環境，為神經再生創造了有利條件。研究發現，該導管具有適宜的機械穩定性和導電性，能夠支持施萬細胞增殖。針織KS在防止瘢痕干擾和促進有序軸突生長方面發揮關鍵作用，而導電水凝膠加速細胞和電信號傳導。在大鼠5毫米坐骨神經缺損模型中，SF/GelMA/Ppy/KS組表現出顯著改善的功能恢復。這種仿生復合神經引導導管為周圍神經再生提供了一種有前景的策略。