10L 搖瓶生物反應器實現 rhA1AT 高效生產，細節全解析

摘要：α1-抗胰蛋白酶（A1AT）是臨床剛需的生物制劑，傳統血漿提取法一直受困于成本高、供應不穩定等瓶頸。近期一項研究帶來了新希望：科研團隊耗時12周篩選出高穩定性、高產量的CHO細胞單克隆株，并首次在10L一次性表面通氣軌道搖瓶生物反應器（SB10-X）中，成功實現重組人A1AT（rhA1AT）的補料分批培養規模化生產。實驗最高效價沖到了789mg/L，細胞比生產力也與搖瓶水平相當。更關鍵的是，研究還完成了rhA1AT的純化與活性驗證，這不僅為擺脫血漿依賴提供了可行方案，也為同類重組蛋白的工業化生產開辟了新思路。

一、臨床剛需下，rhA1AT量產迫在眉睫

A1AT是人體里至關重要的絲氨酸蛋白酶抑制劑，它的核心使命就是抑制中性粒細胞彈性蛋白酶，守護我們脆弱的肺部肺泡組織。作為α1-抗胰蛋白酶缺乏癥的唯一FDA批準治療藥物，它的地位無可替代。有趣的是，近年研究還發現了它的“隱藏技能”——抗炎和免疫調節，這讓它在移植物抗宿主病、糖尿病等領域也展現出潛力。臨床需求在持續攀升，但血漿提取法的短板太明顯了。不僅供體資源有限，還存在潛在的病毒傳播風險，規模化生產更是難上加難。開發重組蛋白生產工藝，已經成了行業必須邁過去的坎。

二、12周嚴苛篩選，鎖定高優CHO細胞單克隆株

要做出好藥，第一步得有好的“細胞工廠”。研究團隊從rhA1AT生產細胞池中，先拿到了10株CHO單克隆細胞。為了找到最能打的那一個，他們進行了長達12周的嚴苛考驗，分別在含300nM MTX和無MTX兩種條件下，觀察細胞的生產穩定性和生長特性（圖1，來源：本文研究數據）。積分活細胞密度（IVCD）、比生長速率、相對比生產力，每一項都是硬指標。數據顯示，不同克隆株的性能差異非常大：Clone 9的相對效價最高，而Clone 2則是“全能選手”，兼顧了高生長速率和穩定的生產力。最終，Clone 2憑借無可爭議的綜合實力，成為了后續規模化生產的核心細胞株（圖2，來源：本文研究數據）。

圖1：10株CHO細胞單克隆株的（a）IVCD、（b）比生長速率、（c）相對Clone 1的最高效價對比

圖2：無MTX（a）和含300nM MTX（b）條件下，10株CHO單克隆株第0-12周的相對比生產力變化

三、10L反應器規模化生產，效價遠超搖瓶水平

確定了Clone 2這個“種子選手”，下一步就是放大生產。團隊先在搖瓶里做了預實驗，最高活細胞密度達到1.17×10?cells/mL，收獲效價437mg/L，這個數據其實已經不錯了。真正的重頭戲，是把工藝放大到10L SB10-X軌道搖瓶生物反應器。實驗做了兩次平行樣，重點考驗了設備對溶氧和pH的調控能力。結果很驚喜，溶解氧穩定維持在40%以上，pH也精準鎖定在7.1±0.05。反應器里的細胞生長勢頭和搖瓶高度一致，最高活細胞密度甚至沖到了1.29×10?cells/mL（圖3，來源：本文研究數據）。更關鍵的是，兩次實驗的最高效價分別達到789mg/L和729mg/L，比搖瓶水平提升了近80%。這組數據有力地證實了工藝的可放大性，完全超出了預期。

圖3：搖瓶與10L SB10-X反應器兩次實驗的（a）活細胞密度與活力、（b）rhA1AT效價、（c-h）營養物與代謝物變化對比

四、rhA1AT的穩定性與純化：解鎖下游工藝關鍵要點

生產出來只是第一步，能不能穩定、能不能純化，才是決定成本的關鍵。研究團隊首先測試了pH穩定性，結果發現了一個重要特性：rhA1AT在pH7.0時最穩定，一旦pH降到3.0-5.0，可檢測的蛋白量就會大幅下降（圖4，來源：本文研究數據）。這意味著單抗生產中常用的低pH病毒滅活工藝，在這里根本用不了，后續必須開發干熱或去污劑處理等替代方案。在純化環節，團隊設計了一套“深度過濾+兩步層析”的工藝，再結合切向流過濾換液。最終的成果非常漂亮，HPLC檢測呈現出單一的特征峰（圖6，來源：本文研究數據）。純化后，蛋白的彈性蛋白酶抑制活性從37%提升到65%并保持穩定（圖5，來源：本文研究數據），回收率也達到了70%左右。這套工藝的有效性，算是被實打實驗證了。

圖4：pH3.0-7.0條件下，ELISA可檢測的rhA1AT相對保留量

圖5：未純化、陰離子交換層析后、疏水相互作用層析+換液后rhA1AT的相對彈性蛋白酶抑制活性

圖6：（a）rhA1AT細胞培養收獲液、（b）純化后rhA1AT的HPLC色譜圖

五、亮點與展望：搖瓶反應器成生物制造新選擇

聊到這里，這次研究最大的亮點其實已經很清晰了。那就是一次性表面通氣軌道搖瓶生物反應器的首次應用。相比于傳統的攪拌式生物反應器，這款設備操作起來簡直太友好了，不僅簡單，還能有效減少剪切力對CHO細胞的損傷。對于生物醫藥研發，尤其是早期臨床生產來說，一次性耗材的設計大大降低了設備投入和清潔成本，性價比極高。

當然，工藝還有優化的空間。比如乳酸、銨離子等代謝物的積累，還是會影響細胞的存活時間。后續可以從營養配比、補料策略，甚至培養溫度、滲透壓這些細節入手，進一步延長培養周期，把效價再往上推一推。整體來看，這項研究搭建起了從細胞株篩選到10L規模生產，再到純化驗證的rhA1AT完整生產工藝。它不僅為rhA1AT的低成本量產奠定了基礎，也給整個重組蛋白生物制造領域，提供了一個極具參考價值的新范式。

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