《食品科學》：中國農業科學院孟璐博士等：產芽孢細菌檢測方法的研究進展

有些細菌當生長到一定時期時，繁殖速度下降，原生質收縮，在細胞內形成一個圓形、橢圓形或圓柱形的、對不良環境條件具有較強抗性的休眠體，稱為芽孢或內生孢子。芽孢是細菌的休眠體，一個細胞內只形成一個芽孢，一個芽孢萌發也只產生一個營養體。芽孢可以在極端環境中生存并休眠數年，還能夠抵抗高溫、干燥、輻射和有毒化學物質等惡劣環境。在自然界中，芽孢通過水、風等尋找營養環境。因此，它們普遍存在于地球上，并不可避免地進入食物鏈。此外，芽孢極具耐熱的特性使其能夠在各種食品滅菌過程中存活。當環境合適時，食物中的芽孢可萌發并進入營養生長階段，進而引發食品腐敗變質，甚至引發食源性疾病。

芽孢不僅具有致病性，還有很強的致腐能力。因此，對食品中存在的芽孢進行檢測是一項非常必要的工作。

中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所的和曉蘭、鄭楠、孟璐*等對食品中芽孢的各種檢測方法進行總結和整理，如國內外最常采用的培養法、核酸擴增法、流式細胞術等，以期為產芽孢細菌檢測領域提供基礎知識和研究背景。

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基于常規培養的檢測方法

聯合國糧食及農業組織食品法典委員會和世界衛生組織法典標準規定，嬰兒配方奶粉中蠟樣芽孢桿菌的最大可接受數量為102 CFU/g。然而，仍然缺乏可靠的方法及時檢測低水平的蠟樣芽孢桿菌芽孢（＜102 CFU/g）。大多數方法只適用于營養細胞的檢測，芽孢的檢測需要多一個讓其萌發的步驟。ISO7932:2004/AMD1:2020《食品和動物飼料的微生物學 假定性蠟芽孢桿菌的水平計數法 在30 ℃條件下的菌落計數技術》中規定了食品和動物飼料中蠟樣芽孢桿菌的30 ℃菌落計數法，ISO 21871:2006《食品和動物飼料的微生物學 少量假定蠟樣芽孢桿菌測定法 最大可能數技術和檢測辦法》中規定了食品和動物飼料中少量蠟樣芽孢桿菌的最可能計數法。法國標準化協會發布的NFV08-405-1986《食品微生物學 罐頭 嗜熱梭狀芽孢桿菌的檢測》中規定了罐頭中嗜熱梭狀芽孢桿菌的檢測。摩洛哥NM08.0.170-2013《食品微生物學 罐頭食品的原料 嗜熱芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌耐熱孢子的計數 最可能計數法》中規定了罐頭食品原料中嗜熱芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌、耐熱芽孢的最可能計數法。

目前，我國標準中常用到的也是培養鑒定法，檢測時間受鑒定方法和菌種而異。GB 4789.14—2014《食品微生物學檢驗 蠟樣芽胞桿菌檢驗》中蠟樣芽孢桿菌檢測采用平板計數法和最可能數（MPN）法，平板計數法用于含量較高的食品中蠟樣芽孢桿菌的計數，MPN法適用于含量較低的食品中蠟樣芽孢桿菌的計數，檢測時間為5～7 d。對于芽孢的檢測標準，我國只有NY/T 1331—2007《乳與乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜熱需氧芽孢數的測定》規定了乳與乳制品中需氧芽孢總數的測定，先80 ℃熱處理10 min，再36 ℃培養48 h；對于嗜熱需氧芽孢的檢測，先100 ℃熱處理30 min，再55 ℃培養48 h。SN/T 0178—2011《出口食品嗜熱菌芽胞（需氧芽胞總數、平酸芽胞和厭氧芽胞）計數方法》中規定了谷物產品、食品配料和固態乳品（全脂奶粉、脫脂奶粉和奶酪制品）中嗜熱菌芽孢的計數，106 ℃熱處理30 min，再55 ℃培養48 h。

培養分離鑒定法靈敏度高，但需要大量的人力，且操作繁瑣、耗時長。使用常規培養方法鑒定特定細菌種類是一個漫長而困難的過程。MPN計數中，需要通過一系列進一步的生理生化實驗確認是否為特定細菌。由于陽性樣品的鑒定需要幾天的時間，而且無法使用特定的媒介或表型標記區分不同的物種，這種方法往往難以適應生產過程的需要。對此，有很多學者對常規的培養法進行了研究和改進。Eijlander等研究發現100 ℃加熱30 min與106 ℃加熱30 min具有相同的預測值。Murphy等研究發現一般耐熱芽孢為80 ℃熱處理12 min，32 ℃培養48 h；中等耐熱芽孢為100 ℃熱處理30 min，55 ℃培養48 h；極度嗜熱芽孢為106 ℃熱處理30 min，55 ℃培養48 h是奶粉中芽孢可靠計數的最佳方法。檢測限達10 CFU/mL。Br?ndle等開發了一種基于光密度值和阻抗水平的對梭狀芽孢桿菌具有最佳選擇性的培養液，能夠通過培養物光密度值隨時間的變化從而檢測梭狀芽孢桿菌芽孢的萌發和生長，檢測限達30 spores/L。

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基于核酸擴增的檢測方法

聚合酶鏈式反應（PCR）是一種檢測和擴增生物體中DNA（或cDNA）的方法。原則上，這種技術類似于體內轉錄和克隆。通過變性、退火和延伸過程，從每個雙鏈DNA分子中獲得一條新的和一條舊的DNA鏈，新產生的DNA片段在隨后的循環中充當模板，這使得DNA靶被指數擴增數百萬倍。近年來，基于核酸擴增的原理，開發了很多檢測不同產芽孢細菌和芽孢的方法，如熒光定量PCR法、環介導等溫擴增法和實時熒光重組酶聚合酶等溫擴增法等（表1）。PCR具有特異性強、靈敏度高、簡單快速、成本低、樣本需求量小等優點，同時由于食品物質和化學物質的存在會抑制PCR，造成假陰性。Cecere等利用甲酚紅染料對pH值的敏感性，開發了能夠通過熒光或肉眼讀數的比色環介導等溫核酸擴增法，對檢測牛奶樣品中的酪丁酸梭菌芽孢具有特異性高、靈敏度高等優點。Mertens等評估了11 個商業DNA提取試劑盒，用于實時定量PCR（qPCR）檢測乳制品中的炭疽芽孢桿菌芽孢，結果表明qPCR檢測結果直接取決于針對單個食品基質和細菌制劑所用的DNA提取方法。

另外，隨著PCR的廣泛使用，也出現了PCR方法結合其他新檢測技術的研究。Létant等開發了一種基于PCR的最可能計數法，具有很好的特異性。楊大偉等報道了一種PCR結合變性高效液相色譜檢測凝結芽孢桿菌的新方法，以凝結芽孢桿菌寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基為靶基因對PCR體系進行優化，可以靈敏地檢測最低量為100 CFU/mL的凝結芽孢桿菌。

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基于染料熒光的檢測方法

基于染料熒光的檢測方法是借助碘化丙啶（PI）、SYTO系列、5-羧基熒光素二乙酸酯（cFDA）等熒光染料，使用熒光顯微鏡、流式細胞儀等設備，通過營養細胞和芽孢不同的形態和熒光強度的特性，進行營養細胞和芽孢的定性、定量檢測。作為一種高通量、高含量的單細胞分析技術，流式細胞術廣泛應用于醫學研究領域，隨著研究的深入，畜牧業、食品業等領域應用也越來越頻繁。進入流式系統的細胞被控制高速定向通過細管，細管處會有一束來自照亮光源的光束，當細胞通過時，光束產生不同程度的散射信號，被分別負責前向散射和側向散射的探測器所接收，前向散射通常與細胞的大小呈正相關，而側向散射與細胞的復雜程度呈正相關，從而得到不同的流式細胞圖像。利用熒光顯微鏡能夠清楚地觀察到細胞發出的熒光顏色和強弱，通常會被用來驗證流式細胞術的圈門結果。近年來，有許多使用流式細胞術測定益生菌和致病菌芽孢的報道（表2）。Somerton等對4 種不同熒光染料技術的流式細胞術與平板計數法對牛奶中蠟樣芽孢桿菌的計數進行了比較，結果發現，cFDA-PI、CellROX? Green-PI和3,3’-二己基氧雜羰花青碘化物（DiOC）染料技術與平板計數具有相似的準確性，而SYTO 24-PI染料技術準確性不佳。

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基于DPA的檢測方法

DPA是芽孢的特有物質，通常以鈣鹽的形式存在，占芽孢干物質的5%～15%，在穩定細菌DNA和維持其正常功能方面起著重要作用。它被視為芽孢微生物的一種合適的臨床生物標志物。對于DPA的檢測，有分光光度法、拉曼/表面增強拉曼散射法、紅外光譜法、熒光和光致發光法等。近年來，通過檢測DPA含量計數環境和食物中的芽孢研究不斷被報道（表3）。Cable等比較了Sm、Eu、Tb和Dy配合物與大環1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,7-二乙酸酯（DO2A）與相應的鑭系元素水離子的有效性，發現Tb(DO2A)+二元復合物是一種快速、穩健的DPA受體，用于檢測細菌芽孢。Li等報告了一種基于熒光聚芴點作為支架與鑭系離子協調的熒光傳感器，借助吡啶二羧酸鈣的敏化作用，能夠檢測到含0.2 nmol/L的吡啶-2,6-二甲酸鈣（CaDPA）。Cowcher等使用改進的銀膠體底物表面增強拉曼散射對芽孢桿菌屬芽孢的生物標志物DPA進行便攜式定量檢測，檢測限達29.9 nmol/L。Pu Shan等將Tb3+與谷胱甘肽（GSH）修飾的銅納米團簇（CuNCs）結合，構建了一種基于Tb-GSH-CuNCs的聚集誘導發光（AIE）熒光探針，結合多色傳感和智能手機應用程序使其成為可通過肉眼識別的便攜式平臺，用于在0.5～70 μmol/L范圍內量化DPA，在現場環境監測中展現出巨大潛力。Jiang Guangzheng等使用天然墨魚骨衍生有機基質（CDOM）/銀納米顆粒檢測蠟樣芽孢桿菌芽孢的DPA，能夠在30 min內完成牛奶等食品中40～1 000 nmol/L的DPA定量分析。

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其他檢測方法

對于芽孢的檢測，除了研究較多的PCR法、流式細胞術和微量DPA檢測法外，還有基于芽孢與納米粒子結合成復合體的物理化學變化、芽孢抗原與標記抗體的特異性結合、質譜、色譜等方法定量芽孢的報道（表4）。Rizzotto等將5’端化學修飾的硫醇基團BAS6R共價連接到金納米顆粒（AuNPs）上，結合并聚集到芽孢表面，再通過芽孢/BAS6R@AuNPs復合體催化過氧化氫介導的四甲基聯苯胺（TMB）氧化并誘導顏色變化定量水、牛奶和土豆泥中的產毒素芽孢桿菌芽孢，檢測速度快、成本低、特異性高，水和牛奶的檢測限為102 CFU/mL，土豆泥的檢測限104 CFU/mL。Daufouy等描述了一種嗜熱脂肪地芽孢桿菌芽孢特異性適配體的選擇方式，是未來開發專門用于檢測嗜熱脂肪地芽孢桿菌芽孢的生物傳感器的起點。Whiteaker等通過質譜儀檢測芽孢中的小酸溶蛋白，并與芽孢濃縮方法相結合，能夠在90 min內檢測出炭疽芽孢桿菌芽孢含量，檢測限達104 spores/mL。Dybwad等建立并驗證了實驗室基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）分析方法，能夠在30 min內鑒定出可疑粉末樣品中的炭疽芽孢桿菌芽孢，具有快速、特異、敏感、穩健等優點。Ryzhov等采用MALDI-TOF-MS快速表征了蠟樣芽孢桿菌的芽孢，通過電暈放電等離子體（CPD）或超聲處理芽孢，將蠟狀芽孢桿菌群的芽孢與枯草芽孢桿菌和球狀芽孢桿菌的芽孢區分開。

此外，宏基因組測序和全基因組測序等DNA測序技術也逐漸應用于芽孢的檢測。與傳統的培養法相比，宏基因組測序避免了培養過程的誤差，縮短了檢測時間，能夠區分屬水平的所有細菌和識別到在培養過程中不易識別或不易培養的芽孢菌種。Li Ning等采用宏基因組測序方法比較了我國4 個季節6 個地區的165 份生乳樣品，共鑒定出4 個屬207 種芽孢，還發現季節性變化對原料奶中芽孢的組成和豐度的影響大于地區。McHugh等使用鳥槍法宏基因組測序技術檢測了乳清粉中的芽孢，并認為鳥槍法宏基因組測序在檢測芽孢方面具有重要價值，有助于產品加工工藝的優化，能夠降低芽孢污染風險。全基因組測序是對單個菌落的整個基因組進行測序的過程，提供了目標細菌的基因組序列信息，能夠實現對目標菌株的準確分型，有助于揭示系統發育和進化趨勢以及控制芽孢的方法。同時，能夠反映出目標細菌本身帶有的與毒素、脂肪酶、蛋白酶和生物膜形成等有關的基因情況。Sornchuer等對從食品中分離出的蠟樣芽孢桿菌菌株進行了全基因組測序，探討了與蠟樣芽孢桿菌耐熱表型相關的蛋白、機制，以及與抗生素耐藥性和毒力相關的基因。Li Fang等對脫脂奶粉中的23 株分離株進行了全基因組測序，結果有16 株被鑒定為地衣芽孢桿菌，4 株為

Bacillus paralicheniformis

Bacillus

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結 語

芽孢檢測培養法進行檢測需要至少48 h，如果再加上生理生化鑒定，需要5～7 d，只能達到追溯的目的，實踐性較低。PCR法和流式細胞術可以很好地解決這一問題，把檢測時間縮短在1 d之內。PCR法具有簡單快速、特異性高、靈敏度高、結果可靠、成本低、易于標準化等優點，然而由于食品雜質的影響，擴增效率受到限制，存在一定的假陰性。流式細胞術具有簡單快速、靈敏度高、特異性高等優點。相比于檢測高濃度細菌，當細菌濃度較低時，流式細胞術花費時間延長，檢測結果準確度下降。新出現的檢測方法是基于芽孢中的特有物質DPA，通過DPA的含量對芽孢定量分析。目前的研究是利用鑭系元素（銪離子、鋱離子）與DPA發生熒光敏化作用，提高熒光強度實現芽孢檢測。這種方法能適用于現場檢測的需要，具有實時快速、靈敏度高、準確度高、穩定性強等優點。其他還有通過抗原抗體特異性結合、質譜、色譜等方法也能夠實現芽孢的快速實時檢測，具有準確率高、特異性高、靈敏快速等特點。

目前，關于芽孢的快速檢測方法，大多數是針對炭疽芽孢桿菌。這是因為炭疽芽孢桿菌為人畜共患病原菌，具有嚴重的致病性，因該菌引起的炭疽病遍及世界各地，極大地影響了社會公共衛生和經濟的發展，及時、快速、靈敏地檢測炭疽芽孢對預防疾病暴發具有重要意義。其次研究較多的是蠟樣芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。有些蠟樣芽孢桿菌會產生腸毒素，造成嚴重的惡心、嘔吐和腹痛癥狀，危害消費者的身體健康。研究最少的是不具有致病性的產芽孢細胞，如嗜熱脂肪地芽孢桿菌。雖然其不具有致病性，但具有很高的致腐能力，嚴重影響產品的貨架期。

隨著科學技術的不斷發展，很多芽孢的快速檢測方法被報道。然而這些方法均是針對某一特定菌株芽孢進行定量，或者是能夠對兩三種芽孢菌進行區分計數，但是仍然缺乏對總芽孢的快速計數檢測方法。在未來，如果能夠開發出總芽孢數的快速檢測方法，不只是針對某一種菌株的致病性或致腐性進行研究，而是綜合考慮微生物的致腐性和致病性，對于提高食品安全檢測效率，保障消費者食用安全具有重要意義。

引文格式：

和曉蘭, 鄭楠, 趙艷坤, 等. 產芽孢細菌檢測方法的研究進展[J]. 食品科學, 2025, 46(9): 391-400. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240913-105.

HE Xiaolan, ZHENG Nan, ZHAO Yankun, et al. Research progress in detection methods for spore-forming bacteria[J].Food Science, 2025, 46(9): 391-400. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240913-105.

實習編輯：梁雯菁；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網

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