Nature?|?突破序列限制：利用DNA三向連接實現通用自組裝，構建復雜DNA序列

撰文 | Enigma

隨著DNA測序和編輯技術（如長讀長測序和CRISPR-Cas系統）的飛速發展，從頭合成（de novo）長片段、復雜且多樣化的DNA序列的能力卻嚴重滯后，成為工程化研究和理解生物學的關鍵瓶頸。當前所有DNA組裝技術（如聚合酶循環組裝（PCA）、Gibson組裝、Golden Gate組裝等）都依賴于最終構建序列本身所含的信息（如互補的單鏈粘末端overhangs）來指導片段連接 ， 導致用于指導組裝的序列（粘末端）本身會成為最終序列的一部分，因此，無法在不改變最終產物序列的前提下，對這些引導序列進行獨立、廣泛的優化，以最大化組裝效率和特異性。這種內在局限性導致了錯誤組裝，從而限制了合成產物的效率、大小和復雜性。

為解決這一根本性難題，近 日， 加州理工學院 王開航 團隊 在Nature期刊發表題為 Construction of complex and diverse DNA sequences using DNA three-way junctions 的研究論文，開發出名為 Sidewinder 的新型DNA組裝技術，利用DNA三向連接（three-way junction, 3WJ）將組裝指導信息與最終序列分離，實現了真正的序列無關性組裝，為復雜 DNA 構建開辟了全新路徑。

本研究的工作流程主要圍繞Sidewinder技術的開發、驗證、應用和性能評估展開，核心創新 在于 Sidewinder技術原理設計 。 與傳統的雙鏈連接（2WJ）不同，Sidewinder利用DNA三臂連接結構。每個組裝片段由一條“條形碼”寡核苷酸和一條“編碼”寡核苷酸退火形成異源雙鏈。片段末端包含兩個關鍵部分：一是短的“立足點”序列（t/t*，類似傳統粘末端），二是長的、唯一的“Sidewinder條形碼”序列（b/b*）。關鍵突破在于，條形碼序列僅用于指導組裝，通過形成“側向螺旋”（Sidewinder helix）將兩個片段精確對齊，并促使互補但不穩定的立足點靠近、穩定，最終通過連接酶連接。連接后，側向螺旋可以被移除，從而在最終序列中無痕恢復標準的雙鏈連接。這實現了組裝指令（條形碼）與最終編碼序列（立足點及其連接產物）的物理分離。

通過可行性驗證后進行規模化組裝，傳統技術在5片段以上組裝就易出現錯配，而Sidewinder技術可輕松實現40個片段的一次性組裝，構建 LuxABCDE 操縱子片段。納米孔測序顯示，96.72%的測序reads為目標產物，且 100% 的正確產物中片段順序完全無誤。連接點分析更是檢測到22533個連接位點，無一錯配，展現出極高的組裝保真度。

為證明其序列無關性，作者選擇了兩個極具挑戰性的序列：一是人載脂蛋白E（ApoE）的高GC含量（70%，局部達95%）編碼序列，拆分為12個片段進行組裝，納米孔測序顯示 99.89% 的產物為正確組裝，50636 個連接位點全部無誤。二是來自Glyphotaelius pellucidus絲蛋白H-Fibroin的高度重復序列片段。為了將挑戰推到極限，構建高度重復的蠶絲蛋白h-fibroin片段，即使采用完全相同的toehold序列（傳統技術無法實現），仍能實現5片段精準組裝，正確組裝率達99.19%。

進一步將編碼不同顏色表型標記蛋白（mScarlet，mGl，aeBlue）的三個獨立的十片段組裝體系混合在同一個反應管中實現一鍋法并行組裝。Sidewinder技術可實現三者的獨立精準組裝。通過特異性引物擴增，每個基因均能得到單一目標條帶，正確組裝率均超過95%，轉化后大腸桿菌克隆均呈現預期表型，為高通量基因合成提供了高效方案。

總而言之，本研究開發并驗證了Sidewinder技術——一種基于DNA三向連接的革命性DNA組裝技術。它從根本上解決了傳統方法中組裝指令與最終序列耦合的固有矛盾，實現了真正的序列無關組裝。該技術能夠以前所未有的保真度、規模和復雜度從頭合成DNA，包括大規模多片段組裝、高GC/高重復序列、并行多構建體組裝以及高覆蓋度的組合文庫。

其科學價值在于為合成生物學和基因工程提供了一個全新的、功能強大的“寫作”工具，極大地擴展了可合成DNA序列的設計空間。應用價值廣泛，可應用于合成基因組學、人工智能輔助的蛋白質設計、新型生物材料開發、蛋白質定向進化以及需要高復雜度DNA構建體的基礎研究等領域。Sidewinder技術有望彌合DNA“讀”、“編”、“寫”能力之間的差距，推動生物工程進入新階段。

https://www.nature.com/articles/s41586-025-10006-0

制版人： 十一

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