藥學2區（4.7）-Int Immunophar-冬凌草乙素通過雙重抑制RIPK1介導的神經炎癥和壞死性凋亡改善阿爾茨海默病

【寫在前面】：本期推薦的是由成都中醫藥大學、中國科學院昆明植物研究所等研究團隊合作近期發表于International Immunopharmacology(IF4.7）的一篇文章，揭示冬凌草乙素通過雙重抑制RIPK1介導的神經炎癥和壞死性凋亡改善阿爾茨海默病。

【期刊簡介】

【題目及作者信息】

Ponicidin ameliorates Alzheimer's disease through dual inhibition of RIPK1-mediated neuroinflammation and necroptosis

冬凌草乙素是從冬凌草中分離得到的一種二萜類化合物，具有廣泛的藥理活性，包括抗炎作用。然而，其在阿爾茨海默病中的治療潛力，特別是在調控受體相互作用蛋白激酶1介導的神經炎癥和壞死性凋亡方面的作用，尚未得到充分探索。本研究旨在探討冬凌草乙素靶向RIPK1以緩解AD發病機制的途徑。通過生物膜層干涉技術和藥物親和反應靶點穩定性實驗，證實了冬凌草乙素與RIPK1之間的相互作用。在體外，使用酶聯免疫吸附測定、逆轉錄實時定量聚合酶鏈式反應、蛋白質印跡法和流式細胞術，評估了冬凌草乙素對BV2小膠質細胞和HT22海馬神經元細胞的炎癥反應及壞死性凋亡的影響。在體內，通過對5×FAD轉基因AD模型小鼠進行行為學測試、組織學分析和生化檢測，評估了冬凌草乙素的治療效果。研究發現，冬凌草乙素能以高親和力與RIPK1結合，并增強RIPK1對蛋白水解降解的抵抗能力。在小膠質細胞中，冬凌草乙素通過破壞RIPK1-JAK1-STAT1信號通路，有效抑制了促炎細胞因子IL-6和TNF-α的釋放。在神經元中，冬凌草乙素通過阻斷RIPK1-RIPK3-MLKL級聯反應，抑制了RIPK1介導的壞死性凋亡。對5×FAD小鼠的行為學分析表明，冬凌草乙素治療能顯著改善認知功能，減少腦內β-淀粉樣蛋白斑塊沉積，并減輕神經炎癥和壞死性凋亡。冬凌草乙素通過靶向RIPK1，對AD中兩個關鍵的病理過程——神經炎癥和壞死性凋亡——產生雙重神經保護作用。這些發現凸顯了冬凌草乙素作為AD疾病修飾療法的潛力，并為天然產物來源的RIPK1抑制劑在神經退行性疾病中的臨床開發提供了基礎。

【前言】

阿爾茨海默病（AD）是一種進行性、致殘性的神經退行性疾病，主要表現為記憶喪失、認知功能障礙和行為異常。AD的標志性病理特征包括β-淀粉樣蛋白（Aβ）斑塊沉積和由Tau蛋白過度磷酸化導致的神經原纖維纏結形成。然而，越來越多的證據表明，這些經典病理的發生和發展并非僅由蛋白質聚集引起，而與神經炎癥的慢性激活和神經元死亡密切相關。目前AD的標準治療主要包括膽堿酯酶抑制劑（如多奈哌齊、卡巴拉汀、加蘭他敏）和N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑（如美金剛）。雖然這些療法能夠緩解癥狀，但無法阻止或逆轉疾病進展。近年來，抗Aβ單克隆抗體（如侖卡奈單抗和多奈單抗）作為疾病修飾療法顯示出一定潛力。然而，其臨床應用受限于高昂的成本、復雜的給藥方案以及腦水腫和出血等安全性問題，且其神經保護作用相對有限。因此，迫切需要探索新的病理機制和分子靶點，以開發更安全、更有效的AD治療策略。

慢性神經炎癥在AD發病機制中起關鍵作用。活化的小膠質細胞和星形膠質細胞釋放一系列促炎細胞因子，包括白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）。這些細胞因子通過JAK1/STAT1通路傳遞炎癥信號，誘導下游基因轉錄并放大炎癥反應。在AD患者和動物模型中，JAK1/STAT1通路常被過度激活，特別是STAT1磷酸化水平升高，從而維持膠質細胞的促炎表型，加劇神經炎癥。抑制JAK1/STAT1信號已被證明可以減輕膠質細胞過度活化，促進Aβ清除，并改善突觸功能和認知缺陷。重要的是，受體相互作用蛋白激酶1（RIPK1）已成為這一炎癥級聯反應中的關鍵上游分子，作為細胞死亡和炎癥信號交匯點的核心調控因子。在AD小膠質細胞中，異常的RIPK1激活促進了促炎細胞因子的釋放，并通過JAK1/STAT1信號放大炎癥，形成神經炎癥的惡性循環。

除了炎癥，壞死性凋亡——一種受調控的程序性細胞死亡形式——已被認為是導致AD神經元丟失的主要機制。該過程由死亡受體信號（如TNF-α/TNFR1）觸發，并依賴于RIPK1激酶活性：當凋亡被阻斷時，RIPK1與RIPK3相互作用并募集MLKL，形成壞死小體復合物，最終導致細胞膜破裂和細胞內容物釋放。與凋亡不同，壞死性凋亡會釋放大量損傷相關分子模式（DAMPs），進一步加劇炎癥。研究表明，在AD患者大腦中，RIPK1、RIPK3和MLKL的磷酸化水平顯著升高，且與磷酸化Tau蛋白的積累以及Braak分期進展相關。此外，RIPK1水平與腦重量和認知功能呈負相關，表明其異常激活加速了神經元丟失。在臨床前模型中，Aβ寡聚體負荷的增加與pMLKL表達升高有關，并且通過基因或藥理學方法抑制壞死性凋亡均能有效緩解Aβ誘導的神經元變性和認知障礙。此外，由Aβ激活的小膠質細胞釋放的TNF-α可通過TNF/RIPK1軸誘導神經元壞死性凋亡，阻斷該通路能有效防止神經元損傷。這些發現突顯了AD中炎癥與壞死性凋亡的相互促進關系，而RIPK1則充當了二者的關鍵樞紐。動物模型研究進一步支持了抑制RIPK1激酶活性可顯著減輕炎癥、保護神經元并改善AD樣病理和認知功能的觀點。目前已有數種小分子RIPK1抑制劑進入臨床開發階段，其中包括可滲透腦屏障的抑制劑SAR443060（DNL747），該藥已進入針對AD患者的II期臨床試驗。這些進展凸顯了RIPK1作為AD治療的一個有前景的靶點。

傳統草藥為中樞神經系統疾病提供了豐富但尚未被充分利用的生物活性化合物資源。在東亞草藥中，冬凌草（Rabdosia rubescens）素有治療炎癥性疾病的歷史。該植物的藥理作用歸因于多種植物化學物質，包括二萜、三萜、生物堿、黃酮類和多糖。冬凌草乙素（Pon）是從冬凌草中分離得到的一種對映-貝殼杉烷型二萜化合物，具有廣泛的藥理活性，包括抗炎、神經保護和抗腫瘤作用。在糖尿病并發癥模型中，Pon下調IL-1β、TNF-α和IL-6等促炎細胞因子，同時上調IL-4和IL-10，從而改善炎癥狀態。在神經元中，Pon減輕了Aβ1-42誘導的損傷，并通過激活SIRT1-PI3K/Akt通路發揮保護作用。此外，Pon在各種疾病模型中顯示出抗氧化和抗凋亡活性，并能誘導腫瘤細胞周期停滯和程序性細胞死亡，突顯了其多靶點藥理潛力。盡管其藥理特性前景廣闊，但Pon在AD模型中的體內效應及其對壞死性凋亡的影響此前尚未明確。本研究表明，Pon直接靶向RIPK1，減弱小膠質細胞中RIPK1-JAK1-STAT1炎癥通路，并阻斷神經元中RIPK1-RIPK3-MLKL介導的壞死性凋亡，從而顯著改善5×FAD小鼠模型的認知缺陷。這些發現不僅揭示了Pon先前未被認識的機制，并通過確定RIPK1為其直接靶點填補了天然產物藥理學中的一個關鍵空白，而且為理解AD的潛在病理過程提供了新見解。

【結果部分】

1. 冬凌草乙素的直接分子靶點：RIPK1。

圖1 冬凌草乙素抑制促炎細胞因子產生并靶向RIPK1。(A) 冬凌草乙素的化學結構，這是一種從冬凌草中分離得到的天然二萜化合物。(B–C) RT-qPCR分析顯示冬凌草乙素在BV2細胞中抑制促炎細胞因子的轉錄。細胞先用冬凌草乙素（5 μM）或Nec-1（10 μM）預處理30分鐘，再用LZ刺激4小時。Tnf-α和Il-6的相對mRNA表達水平經Gapdh歸一化后進行定量。(D–E) ELISA結果顯示冬凌草乙素減少LZ誘導的細胞因子分泌。BV2細胞先用冬凌草乙素（5 μM）或Nec-1（10 μM）預處理30分鐘，再用LZ刺激8小時。測定上清液中IL-6和TNF-α的水平。(F) BV2細胞以每孔1.2 × 10?個細胞接種于96孔板，培養18小時。進行冬凌草乙素處理時，從100 μM開始進行系列稀釋，直至1.56 μM（共8個濃度）。處理8小時后，使用CCK-8法評估細胞活力。測得冬凌草乙素的CC50為59.360 ± 3.58 μM。(G) BLI分析顯示冬凌草乙素與RIPK1的結合相互作用，解離常數KD為135 nM。(H) DARTS實驗證明冬凌草乙素增強了HT22細胞中RIPK1對蛋白水解降解的抵抗能力。細胞接種于10 cm培養皿，培養18小時后進行DARTS實驗。

2.冬凌草乙素經由RIPK1–JAK1–STAT1軸緩解小膠質細胞神經炎癥。

圖2 冬凌草乙素通過抑制RIPK1–JAK1–STAT1信號軸減輕神經炎癥。 (A-B) BV2細胞用遞增濃度的冬凌草乙素處理，隨后用LZ刺激8小時。通過ELISA測定IL-6和TNF-α水平，計算抑制率并確定半抑制濃度。(C–K) 冬凌草乙素（5 μM）與Nec-1（10 μM）抑制BV2細胞中LZ誘導的RIPK1、JAK1和STAT1磷酸化。細胞經冬凌草乙素或Nec-1處理30分鐘后，用LZ刺激4小時。通過蛋白質印跡分析蛋白水平，以Actin作為內參蛋白。

3.冬凌草乙素通過抑制RIPK1–RIPK3–MLKL級聯反應阻斷神經元壞死性凋亡。

圖3 冬凌草乙素通過阻斷RIPK1–RIPK3–MLKL信號通路抑制神經元壞死性凋亡。(A) BV2細胞以每孔1.2 × 10?個細胞接種于96孔板，培養18小時。使用冬凌草乙素處理時，從100 μM開始進行倍比系列稀釋至1.56 μM（共8個濃度）。處理8小時后，采用CCK-8法檢測細胞活力，測得其CC50為29.50 ± 0.204 μM。(B) 在經冬凌草乙素（5 μM）預處理30分鐘、隨后用TZ刺激的HT22神經元中進行LDH釋放的時序測定。(C) 對Hoechst（藍色，細胞核染色）和PI（紅色，死細胞標記物）染色的HT22細胞進行高內涵成像分析。HT22神經元經冬凌草乙素（5 μM）或Nec-1（10 μM）預處理30分鐘后，用TZ刺激8小時。“Merge”圖像為Hoechst與PI染色的疊加。(D) 各組細胞死亡百分比的定量分析。(E) 流式細胞術分析經冬凌草乙素或Nec-1預處理30分鐘、隨后用TZ刺激8小時的HT22神經元的壞死性凋亡情況。壞死細胞在Q2象限進行定量。(F) 流式細胞術Q2象限的定量分析。(G-M) 冬凌草乙素和Nec-1抑制RIPK1、RIPK3和MLKL的磷酸化。細胞經冬凌草乙素或Nec-1處理30分鐘后，用TZ刺激4小時。

4.冬凌草乙素通過抑制RIPK1緩解炎癥微環境誘導的神經元壞死性凋亡。

圖4 冬凌草乙素抑制小膠質細胞誘導的HT22神經元壞死性凋亡。(A) 采用高內涵成像分析HT22細胞經BV2細胞上清液刺激8小時后的情況（實驗方法詳見第2.4節）。HT22細胞經Hoechst（藍色，細胞核染色）與PI（紅色，死細胞標記物）染色，“Merge”圖像顯示Hoechst與PI染色的疊加。(B) 各組細胞死亡百分比的定量分析。(C) LDH檢測表明，冬凌草乙素與Nec-1均能顯著降低BV2-LZ-su誘導的神經元細胞毒性。(D) 將TNF-α抗體與HT22神經元預孵育后，再用BV2-LZ-su處理。活細胞比例分析顯示，TNF-α是HT22細胞中壞死性凋亡的主要介導因子。(E-K) 蛋白質印跡分析表明，冬凌草乙素或Nec-1處理能減弱BV2-LZ-su刺激的HT22細胞中RIPK1、RIPK3和MLKL的磷酸化。

5.冬凌草乙素通過抑制神經炎癥與壞死性凋亡改善5×FAD小鼠的認知缺陷。

圖5 冬凌草乙素改善5×FAD轉基因小鼠的認知功能。 (A) T迷宮實驗示意圖。(B–D) T迷宮實驗結果顯示，與未處理的5×FAD小鼠相比，經冬凌草乙素（10 mg/kg）或Nec-1（10 mg/kg）處理的5×FAD小鼠在探索新臂時行進距離更長、進入新臂次數更多、探索新臂的潛伏期更短。(E) Y迷宮實驗示意圖。(F–H) Y迷宮實驗數據表明，與未處理的5×FAD小鼠相比，冬凌草乙素（10 mg/kg）和Nec-1（10 mg/kg）處理使5×FAD小鼠探索新臂的行進距離更長、進入新臂次數更多、探索新臂的潛伏期更短。

圖6 冬凌草乙素改善5×FAD轉基因小鼠的空間學習與記憶能力。(A) 巴恩斯迷宮實驗示意圖。(B–D) 巴恩斯迷宮結果顯示，與未處理的5×FAD小鼠相比，經冬凌草乙素（10 mg/kg）或Nec-1（10 mg/kg）處理的5×FAD小鼠表現出更短的目標區潛伏期、更少的目標區錯誤次數以及更低的目標區偏離度。(E) 探索試驗期間的代表性游泳軌跡。(F) 第5天的莫里斯水迷宮探索試驗顯示，與未處理的5×FAD小鼠相比，經冬凌草乙素（10 mg/kg）或Nec-1（10 mg/kg）處理的5×FAD小鼠在平臺區域停留時間更長。

圖7 冬凌草乙素治療減少5×FAD小鼠的Aβ斑塊沉積并減輕神經炎癥與壞死性凋亡。(A–L) 腦組織蛋白質印跡分析顯示，冬凌草乙素治療降低了APP的表達，減少了JAK1-STAT1通路標記物（pJAK1與pSTAT1）以及促炎細胞因子TNF-α和IL-6的水平。同時，冬凌草乙素通過降低RIPK1、RIPK3和MLKL的磷酸化緩解了壞死性凋亡。以Actin作為內參蛋白。(M) 免疫組織化學分析表明，冬凌草乙素（10 mg/kg）和Nec-1（10 mg/kg）有效減少了5×FAD小鼠海馬和皮層中的Aβ斑塊沉積。

6. 冬凌草乙素雙重保護機制示意圖。

圖8 冬凌草乙素雙重保護機制示意圖。在阿爾茨海默病小鼠模型中，冬凌草乙素通過抑制RIPK1–JAK1–STAT1信號軸，減少小膠質細胞分泌TNF-α等神經炎癥因子，從而緩解神經炎癥；同時，冬凌草乙素阻斷RIPK1–RIPK3–MLKL信號級聯反應，抑制神經元壞死性凋亡。

【結論與討論】

冬凌草乙素通過靶向RIPK1，對AD中兩個關鍵的病理過程—神經炎癥和壞死性凋亡—產生雙重神經保護作用。這些發現凸顯了冬凌草乙素作為AD疾病修飾療法的潛力，并為天然產物來源的RIPK1抑制劑在神經退行性疾病中的臨床開發提供了基礎。

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