改造慢病毒高效靶向T細胞，體內生成CAR-T細胞

近年來，病毒和非病毒載體被開發用于體內T細胞工程，其中慢病毒（LV）載體因能夠通過基因組整合實現CAR轉基因在T細胞中的長期表達而備受關注。然而，用于體外T細胞轉導的泛嗜性水皰性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）偽型LV載體在體內工程中適用性較差，理想情況下載體應特異性靶向目標細胞類型。

近期，來自牛津生物醫學（UK）有限公司的研究團隊在《分子治療》雜志上發表了一項突破性研究，該研究描述了一種改進的重定向Nipah包膜系統與第四代慢病毒載體相結合的方法，能夠在體內特異性靶向T細胞并高效生成功能性CAR-T細胞。

一

研究方法概述

該研究采用了一種創新的四代慢病毒載體平臺（稱為TetraVecta系統），結合重定向的Nipah病毒（NiV）包膜蛋白。研究人員對Nipah包膜蛋白進行了改造，其中G蛋白通過四個點突變（E501A、W504A、Q530A和E533A）防止與天然受體EphrinB2/B3結合，并將靶向分子（如DARPin或VHH）融合到羧基末端以實現特異性靶向。同時，G和F蛋白的胞質尾被截短以促進載體顆粒的偽型化。

縮略圖

此外，研究還采用了 TRiP 系統來抑制CAR轉基因在載體生產過程中的翻譯，減少CAR蛋白摻入載體顆粒的風險。體內實驗使用人源化NCG小鼠模型（植入人CD34+臍帶血干細胞），通過靜脈注射載體評估體內CAR T細胞的生成效率和特異性。

二

主要研究結果

01

改造LV載體增強轉導效率

研究人員首先探索了如何提高重定向LV載體的轉導效率。他們發現，與單鏈可變片段（scFv）相比，使用設計的錨蛋白重復蛋白（DARPin）作為靶向分子能夠顯著提高載體對CD8+ T細胞的轉導效率。

圖1. 使用DARPIN和混合包膜組合提升了用改良NiV包膜偽型的重定向LV載體的轉導效率

如圖1所示，研究團隊對Nipah包膜蛋白進行了系統優化。他們假設，在重定向的Nipah包膜中，靶向分子在附著蛋白C末端的 presence 可能會阻礙G蛋白與F蛋白的相互作用，而這種相互作用是觸發膜融合所必需的。為此，他們開發了一種"混合"包膜組成，將重定向的CD8-NiV Gm△34與非靶向的NiV Gm△34按一定比例混合，同時保留F△22融合蛋白。

實驗結果表明，與100%重定向G蛋白的載體相比，采用混合包膜（75%重定向CD8-NiV Gm△34和25%非靶向NiV Gm△34）的LV載體顯著提高了對CD8+ T細胞的基因轉移效率。通過評估不同比例的重定向與非靶向G蛋白，研究人員確定了50%-75%重定向CD8DARPin-NiV Gm△34和25%-50%非靶向NiV Gm△34的最佳范圍。重要的是，在所有條件下，載體對不表達CD8的細胞群的轉導均保持在最低水平，表明特異性得以保持。

02

不同靶向分子特異性轉導驗證

研究人員進一步評估了不同類型的靶向分子在Nipah重定向系統中的功能。除了DARPin外，他們還測試了單域VHH抗體結合劑對CD8的靶向效果。

圖2. 混合NiV包膜的重新定向LV載體，利用scFv、DARpin或VHH靶向轉導CD4、CD8和CD3 T細胞

如圖2所示，兩種CD8的VHH結合劑（駱駝源VHH和人源化版本）均能夠產生CD8特異性LV載體，其效率優于scFv，與使用CD8 DARPin的載體相當。這表明VHH結合劑可能因其較小的尺寸和較低的聚集傾向而在此設置中同樣有益。

為了靶向所有T細胞亞群或特異性靶向CD4+ T細胞，研究人員還評估了針對CD3和CD4的DARPin結合劑。結果表明，CD3和CD4 DARPins均能有效介導CAR基因向各自T細胞類型的轉移。此外，CD3 DARPin的轉導效率高于CD3 scFv，支持了DARPins在此背景下的實用性。所有重定向載體均顯示了對目標細胞類型的特異性，與VSV-G偽型對照載體形成鮮明對比。

研究人員還評估了不同比例的CD3DARPin-NiV Gm△34和非靶向NiV Gm△34對轉導效率的影響。與100% CD3DARPin-NiV Gm△34的載體相比，混合包膜組成提高了載體對表達目標（CD3+）T細胞的轉導效率。基于這些結果，研究團隊選擇使用75%重定向NiV Gm△34和25%非靶向NiV Gm△34的混合包膜進行后續實驗。

03

改進安全性和最小CAR摻入的第四代重定向LV載體

為了提高載體的安全性，研究人員評估了能否使用在載體生產過程中抑制CAR轉基因翻譯的系統來限制CAR蛋白摻入載體顆粒。

圖3. 利用SupA2KO-LV基因組和TRiP系統制備重定向慢病毒載體，減少了vRNA剪接并防止了CAR被載體顆粒中摻入

如圖3所示，研究采用了TRiP系統的更新版本，該版本在LV載體生產過程中介導轉基因翻譯的抑制。該系統在第四代TetraVecta系統的SupA2KO-LV骨架中表現最佳，該骨架還具有多項改進，可提高載體產品的質量和安全性。

研究表明，使用含有TRAP結合序列（tbs）的SupA2KO-LV載體基因組時，載體顆粒中幾乎檢測不到CAR蛋白，而在第三代LV基因組中，即使存在TRAP蛋白，CAR蛋白仍然可檢測到。這種差異歸因于第三代基因組中主要剪接供體（MSD）的強效剪接產生大量表達CAR的剪接vRNA。

而SupA2KO-LV中的2KO修飾滅活了MSD的剪接，因此在這些額外的CAR編碼RNA缺失的情況下，LV載體產品中檢測不到CAR蛋白。總之，最優化的CAR蛋白從載體顆粒中的去除需要2KO修飾和TRiP系統結合使用。

04

體內高效產生并擴增CAR-T細胞

在體外成功鑒定了這些重定向載體在效率和質量方面的改進后，研究人員評估了它們在體內直接生成功能性CAR+ T細胞的能力。

圖4. 通過靜脈注射第四代SupA2KO-LV載體，靶向CD3或CD8 T細胞，快速高效地在體內生成CAR T細胞

如圖4所示，研究團隊選擇了性能最佳的結合劑進行體內評估，針對CD8的DARPin和人源化VHH，以及針對CD3的DARPin，并使用了上述混合Nipah包膜組成。載體通過靜脈注射注入人源化NCG小鼠模型。

每周通過流式細胞術監測血液中的CAR表達發現，注射重定向載體或高劑量VSV-LV后14-21天內，所有組別均檢測到高水平的CAR+ CD3+和CD8+ T細胞，且顯著高于背景水平。CD3DARPin-LV產生的CAR+ T細胞水平最高（約54%的CD3+細胞）。兩種不同的CD8靶向載體（CD8DARPin-LV和CD8VHH-LV載體）產生的CAR+ T細胞水平相對相似，但略低于CD3DARPin-LV載體。只有CD3DARPin-LV載體產生了相當數量的CD4+和CD8+ CAR+細胞。

盡管VSV-G載體的功能滴度較高，但VSV-LV組產生的CAR+ T細胞數量低于CD3和CD8靶向載體，且呈劑量依賴性。CAR T細胞的頻率在D7時非常低，但到D14-D21時，非常高比例的T細胞呈CAR+，表明轉導后CAR T細胞在體內擴增了2-3周，然后收縮。在D28終止時，BM和脾臟中也檢測到高頻的CAR T細胞，所有載體處理組中BM的CAR+ T細胞比例顯著高于脾臟和血液，可能是由于持續的淋巴細胞生成所致。

05

高效清除B細胞

有效殺傷B細胞并誘導B細胞再生障礙 研究人員評估了B細胞的清除情況，作為CAR T細胞活性的衡量指標。 如圖5所示，所有載體處理組中B細胞的比例在注射后14-21天內顯著下降，到D28時，所有重定向載體處理組和高劑量VSV-LV組均出現嚴重的B細胞再生障礙。B細胞再生障礙的動力學在不同載體間略有差異，VSV-LV組比其他組更早出現B細胞減少，在D7時即顯著下降，而此時CAR T細胞尚不易檢測到。

圖5. 利用第四代重定向SupA2KO-LV載體在體內生成的CAR T細胞，誘導快速且持續的B細胞發育不良

在重定向載體處理組中，CD3DARPin-LV載體對B細胞水平的影響略早于CD8靶向LV載體組。對于VSV-LV組，低劑量和中劑量組的B細胞清除動力學較慢，但后期無統計學差異。

在D28終止時，BM和脾臟中也觀察到顯著的B細胞再生障礙。盡管BM中的B細胞顯著減少，但該組織中殘留的B細胞數量略高于血液和脾臟，推測是由于BM巢中植入的造血干細胞/祖細胞持續產生淋巴細胞所致。

06

CD8和CD3靶向包膜與VSV-G的T細胞靶向性對比

研究人員通過流式細胞術分析血液、BM和脾臟免疫細胞群中的CAR表達來評估靶向載體的特異性。

如圖6所示，所有重定向載體介導的CAR表達主要限于CD3+ T細胞，在其他人類免疫細胞群（NK細胞、單核細胞或B細胞）中檢測到的表達極少。CD8靶向載體的CAR表達主要限于CD8+ T細胞，盡管在少數動物的CD4+ T細胞中檢測到低頻率的CAR+細胞，可能是由于轉導了雙陽性CD8+CD4+前體細胞。

圖6. 體內利用第四代重定向SupA2KO-LV載體對T細胞的特異性靶向

非靶向VSV-G偽型載體的CAR表達也主要局限于T細胞，在其他人類免疫細胞類型中檢測到的表達極少；然而，在高劑量VSV-LV處理的動物中，在脾臟的小鼠CD45+區室中額外觀察到了高頻率的CAR+細胞，但在BM或血液中未觀察到。這些細胞可能是髓系細胞，因為所使用的NCG小鼠模型不產生小鼠淋巴樣細胞。

研究人員還通過分析處理動物肝臟中的整合載體拷貝數（VCN）進一步評估了重定向載體的特異性。正如預期，在用VSV-G偽型載體處理的小鼠肝臟中檢測到高水平載體，且觀察到劑量反應。相反，重定向載體顯示肝臟轉導的證據極少，檢測到的載體拷貝數非常低。

總之，本研究成功改進并將LV重定向包膜與第四代LV平臺相結合，用于在動物研究中特異性高效地向T細胞遞送CAR轉基因。這些改進將推動體內CAR T療法的實施和可行性，通過消除體外制造CAR T細胞的需求，提高患者對這些治愈性療法的可及性。未來研究需要評估低劑量重定向載體對CAR T細胞生成和腫瘤細胞清除的影響，以優化治療劑量并最小化潛在不良反應。

原文連接：

https://www.cell.com/molecular-therapy-family/molecular-therapy/fulltext/S1525-0016(25)00542-8

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