Science | Jennifer Doudna?團隊揭秘細菌抗病毒免疫創(chuàng)新機制：核酸酶?-?蛋白酶對的反復獲取與保守激活

撰文| Enigma

細菌與古菌長期面臨噬菌體的持續(xù)感染壓力，驅(qū)動了 CRISPR-Cas、CBASS、Avs 等多樣化抗病毒免疫系統(tǒng)的進化。這些系統(tǒng)常通過將新基因整合到現(xiàn)有通路實現(xiàn)功能革新，但新獲取基因在不同防御系統(tǒng)中是否遵循統(tǒng)一作用機制、能否形成 “通用功能模塊”，始終是領(lǐng)域內(nèi)待解的核心科學問題。

近日，美國加州大學伯克利分校化學系、創(chuàng)新基因組學研究所 Jennifer A. Doudna 團隊（Owen T. Tuck 與 Jason J. Hu 為共同第一作者）在

Science

研究團隊首先通過序列同源性搜索（使用 Clustal Omega、MAFFT 工具）與結(jié)構(gòu)預(yù)測（基于 AlphaFold3）發(fā)現(xiàn)，Hachiman、AVAST、Lamassu、DRT等4類功能迥異的細菌抗病毒系統(tǒng)中，均存在共現(xiàn)的兩類基因：一是編碼 MBL 型水解酶超家族蛋白的基因（預(yù)測為核酸酶），二是編碼胰蛋白酶樣蛋白酶的基因。其中核酸酶基因通常位于上游，蛋白酶基因則與各系統(tǒng)的核心防御酶（如 Hachiman 的 HamA、AVAST 的 Avs1a、Lamassu 的 LmuA）形成 N 端融合蛋白，這一基因排布在不同系統(tǒng)中高度保守。系統(tǒng)發(fā)育分析（采用 IQ-TREE 2 構(gòu)建進化樹）進一步揭示，除少數(shù) DRT 系統(tǒng)變異體外，這些系統(tǒng)均通過水平基因轉(zhuǎn)移多次獨立獲取該核酸酶 - 蛋白酶基因?qū)Γ液怂崦概c蛋白酶的進化樹拓撲結(jié)構(gòu)高度相似，表明二者存在緊密共進化關(guān)系，轉(zhuǎn)移過程中始終以 “配對形式” 傳遞。值得注意的是，該基因?qū)€存在于未被注釋的基因組 “防御島”（含轉(zhuǎn)座酶等免疫相關(guān)元件）中，暗示其潛在免疫功能；且約 5% 的 Hachiman 系統(tǒng)中，蛋白酶 - HamA 融合蛋白的 HamA 結(jié)構(gòu)域失去經(jīng)典 D-GEXK 催化基序，表明這些系統(tǒng)通過 “失活自身核酸酶功能、依賴新獲取的 MBL 型核酸酶” 實現(xiàn)免疫重塑，進一步印證該基因?qū)Φ墓δ芎诵牡匚弧?/p>

圖 1 核酸酶 - 蛋白酶功能模塊的跨系統(tǒng)分布與進化特征

為闡明該模塊的作用機制，團隊以 Pseudomonas fluorescens 的 Hachiman 系統(tǒng)（PflHamMAB locus）為模型展開研究。純化的 HamM（MBL 型核酸酶）單獨孵育時無 DNA 降解活性，AlphaFold3 結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，其 MBL 結(jié)構(gòu)域中存在兩個無序插入片段，恰好覆蓋核酸酶活性中心形成 “門控” 抑制狀態(tài) —— 這與天然轉(zhuǎn)化相關(guān) MBL 核酸酶（如 Bacillus subtilis ComEC）的結(jié)構(gòu)存在顯著差異。將 HamM 與 HamAB 復合物（含蛋白酶 - HamA 融合蛋白、HamB 解旋酶）共孵育后，SDS-PAGE 檢測到 42 kDa 的全長 HamM 消失，出現(xiàn) 3 個特異性水解片段；質(zhì)譜分析（依托 QB3/Chemistry Mass Spectrometry Facility 平臺）定位切割位點為插入片段中的異亮氨酸殘基（I118、I218），且該切割具有高度特異性，HamAB 無法切割其他無關(guān)蛋白，突變異亮氨酸位點后切割完全消失。體外 DNA 降解實驗顯示，單獨 HamM 或 HamAB 孵育質(zhì)粒 DNA 時僅產(chǎn)生少量切口，二者共孵育時質(zhì)粒 DNA 在 10 分鐘內(nèi)完全降解，且激活后的核酸酶可降解短雙鏈 DNA、單鏈 DNA 及噬菌體 EdH4 的基因組 DNA，但不切割 RNA，證明其底物特異性為 DNA。“預(yù)切割” 實驗進一步證實，在 HamM 的異亮氨酸位點人工引入斷裂后，即使無 HamAB 存在，該 “預(yù)切割 HamM” 也會對宿主 E. coli 產(chǎn)生顯著毒性，直接證明插入片段的移除是核酸酶激活的關(guān)鍵。

該激活過程還需雙重信號調(diào)控以避免誤激活：噬菌體感染產(chǎn)生的 DNA 中間體可觸發(fā) HamB 解旋酶的 ATP 水解，而 ATP 存在時會抑制 HamM 切割，ATP 水解后抑制解除；若加入非水解性 ATP 類似物（AMP-PNP），即使有 DNA 存在，HamM 也無法被激活。同時，刪除 HamA 的 dHamA 結(jié)構(gòu)域后蛋白酶無法激活核酸酶，而將 dHamA 替換為人類 c-Jun 的亮氨酸拉鏈二聚化結(jié)構(gòu)域后，蛋白酶可自主激活核酸酶，證明 HamA 的寡聚化是蛋白酶活性的前提。綜上，Hachiman 系統(tǒng)的激活通路為：噬菌體 DNA→HamB 解旋酶 ATP 水解→蛋白酶 - HamA 寡聚化→切割 HamM 的插入片段→核酸酶激活→DNA 降解→細胞死亡 / 生長停滯→阻斷噬菌體復制。

圖 2 Hachiman 系統(tǒng)中核酸酶的激活機制與信號調(diào)控 從 DNA 感知到核酸酶激活的完整通路，雙重調(diào)控（DNA+ATP 水解）與蛋白酶切割共同實現(xiàn)核酸酶的精準激活

為驗證該機制的普適性，團隊研究了與 Hachiman 無進化同源性的 AVAST 系統(tǒng)（Erwinia piriflorinigrans 的 EpiAvs locus）—— 該系統(tǒng)通過直接識別噬菌體末端酶激活，與 Hachiman 的 DNA 感知模式完全不同。實驗顯示，EpiAvs 系統(tǒng)的核酸酶（EpiAvs1a）同樣含兩個遮擋活性位點的插入片段及保守異亮氨酸切割位點（I134、I234）；突變這些位點后，EpiAvs 對噬菌體 P1 的防御能力顯著下降，雙突變則完全失去防御功能；Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，噬菌體 P1 感染時 EpiAvs1a 被切割產(chǎn)生 18.9 kDa 的特異性片段，突變體無此片段。更關(guān)鍵的是，將 Citrobacter sp. ESBL3 的 AVAST 核酸酶替換 EpiAvs1a，構(gòu)建的嵌合系統(tǒng)仍能有效抵御噬菌體 P1，證明該模塊的功能可跨物種遷移，激活機制具有絕對保守性。此外，Lamassu 系統(tǒng)的核酸酶同樣含類似插入片段，且激活依賴核心蛋白寡聚化，進一步證實 “蛋白酶切割 + 寡聚化調(diào)控” 是多系統(tǒng)共享的激活范式。

系統(tǒng)發(fā)育分析中，團隊還意外發(fā)現(xiàn)一類特殊的核酸酶同源物：其伴侶蛋白酶并非胰蛋白酶樣，而是與真核 caspase 家族（調(diào)控凋亡的關(guān)鍵蛋白酶）高度同源，形成 “caspase - 核酸酶” 基因座（命名為 canu 系統(tǒng)）。以 Klebsiella aerogenes 的 KaeCanABC 系統(tǒng)為模型研究發(fā)現(xiàn)，CanA（caspase 同源物）的結(jié)構(gòu)與人類 MALT1 類胱天蛋白酶（調(diào)控 NF-κB 通路）的 C 端免疫球蛋白樣（Ig 樣）折疊高度同源（DALI Z-score=20.7），且 CanC（核酸酶）含保守的門控插入片段；表達 KaeCanABC 的 E. coli 可有效抵御噬菌體 T4，低感染復數(shù)（MOI=0.01）時可完全阻止裂解，高 MOI（10）時細胞才崩潰；突變 CanA 的 caspase 活性位點或 CanC 的切割位點均會喪失防御功能，體外實驗顯示 CanA 與 CanB 形成可溶性復合物，且 CanAB 濃度越高，CanC 的 DNA 降解活性越強。通過篩選 T4 逃逸突變體，團隊發(fā)現(xiàn)所有逃逸突變均位于 dda 基因（編碼 SF1 家族解旋酶，參與噬菌體 DNA 復制），表明 Canu 系統(tǒng)通過感知噬菌體解旋酶激活防御。這一發(fā)現(xiàn)首次證實原核生物中存在 “caspase - 核酸酶” 激活通路，與真核 caspase 介導的凋亡信號通路存在進化相似性，為理解免疫通路的跨域保守性提供了關(guān)鍵線索。

該研究通過多維度實驗揭示了細菌抗病毒免疫的 “模塊化進化” 規(guī)律，其科學價值體現(xiàn)在三方面：理論層面，明確 “核酸酶 - 蛋白酶對” 是細菌免疫的 “通用功能模塊”，通過水平基因轉(zhuǎn)移實現(xiàn)跨系統(tǒng)功能拓展，修正了 “不同防御系統(tǒng)獨立進化” 的傳統(tǒng)認知；機制層面，闡明 “門控抑制 + 蛋白酶激活 + 多信號調(diào)控” 的保守通路，為理解原核免疫的精準調(diào)控提供新范式，且首次建立原核 caspase 與真核凋亡通路的進化關(guān)聯(lián)；應(yīng)用層面，提供了基于 “共進化特征（核酸酶 - 蛋白酶共現(xiàn)）+ 結(jié)構(gòu)特征（門控插入片段）” 的新型防御系統(tǒng)預(yù)測方法，為挖掘 CRISPR 之外的抗病毒工具奠定基礎(chǔ) —— 例如該模塊的可控激活特性，或可用于優(yōu)化基因編輯工具的脫靶效應(yīng)。

目前，研究團隊已將相關(guān)質(zhì)粒（Addgene ID: 248931-248960）與噬菌體測序數(shù)據(jù)（NCBI SRA: PRJNA1353595）公開，補充材料可通過https://science.sciencemag.org/cgi/content/full/science.aea8769/DC1獲取。未來，對 Canu 系統(tǒng)多樣性的深入探索、以及該模塊在古菌中的分布研究，或?qū)⑦M一步揭示免疫通路的起源與進化規(guī)律。

原文鏈接：https://doi.org/10.1126/science.aea8769

制版人： 十一

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