Int J Biol Macromol-IF8.5 | 藥食同源薏苡仁種子外囊泡可治療潰瘍性結腸炎

大家好，今天分享一篇在著名期刊International Journal of Biological Macromolecules上發表“Emerging nutritional potential of edible-medicinal homologous coix lacryma-jobi seed-derived exosomes for treatment of ulcerative colitis”的研究論文。

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植物來源的外泌體因其對多種炎癥性疾病的顯著治療潛力而引起了廣泛的研究興趣。本研究從薏苡仁種子中分離出外泌體（CLS-Exos），并系統評估了其在潰瘍性結腸炎（UC）小鼠模型中的治療效果。通過密度梯度離心成功分離出CLS-Exos，獲得的顆粒平均直徑為157 nm，zeta電位為-0.098 mV。這些CLS-Exos表現出優異的生物相容性，并能有效抑制活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）和關鍵促炎細胞因子的產生。值得注意的是，CLS-Exos處理顯著下調促炎細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6，同時上調抗炎介質IL-10和細胞保護酶血紅素氧合酶-1（HO-1）。因此，CLS-Exos給藥改善了DSS誘導的結腸炎主要癥狀，包括體重減輕、疾病活動指數（DAI）增加、結腸縮短和結腸黏膜組織病理學損傷。總之，這些發現表明CLS-Exos通過調節炎癥反應，將平衡從促炎狀態轉變為抗炎和修復狀態，從而減輕實驗性結腸炎。

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潰瘍性結腸炎（UC）是慢性炎癥性腸病（IBD）的主要形式，造成重大且日益增長的全球健康負擔。UC的病理特征包括彌漫性、表淺性和連續性黏膜炎癥。UC的確切病因和發病機制仍不完全清楚。它被認為是由遺傳易感性、免疫失調和環境因素的復雜相互作用引起的。已確定的風險因素包括陽性家族史、慢性吸煙和高脂肪飲食。常見的臨床表現包括腹瀉、腹痛和便血（大便帶血）。在嚴重情況下，該疾病可導致嚴重并發癥，如腸穿孔、危及生命的出血，以及長期結直腸癌風險增加。UC通常呈復發緩解型病程。這種慢性和不可預測的性質顯著損害患者的生活質量，在最嚴重的表現中可能危及生命。

UC的異質性和復雜性給臨床管理帶來了重大挑戰。目前的治療選擇有限，主要涉及免疫抑制劑和生物制劑，其中包括已批準的藥物，如5-氨基水楊酸（5-ASA）和抗腫瘤壞死因子-α（TNF-α）抗體用于治療UC。然而，相當比例的患者對可用的藥物治療無效，最終需要手術干預。

外泌體是由各種植物和動物細胞分泌的納米級囊泡，在細胞間通訊中發揮關鍵作用。它們作為天然納米載體的固有特性賦予了優異的生物相容性和組織穿透能力。因此，外泌體具有雙重功能：它們不僅是各種治療化合物的有效遞送載體，而且本身也作為內在治療劑發揮作用。其中，植物外泌體（PENs）因其低毒性和強大的生物活性而引起了顯著關注。例如，Deng等人證明口服西蘭花來源的外泌體有效改善了模型中的急性和慢性炎癥性腸病（IBD）。同樣，Huang等人報道生姜衍生的PENs作為UC靶向治療的有效遞送系統。作為一類新型生物活性納米載體，PENs在UC治療中顯示出相當大的前景。隨著研究繼續揭示其作用機制，它們的治療價值日益得到認可。PENs提供了傳統療法和動物源外泌體的有前景替代方案，整合了幾個關鍵優勢：固有的生物相容性、可擴展生產、低免疫原性和內在靶向能力，從而為UC治療提供了新的戰略方向。

“藥食同源”概念源于傳統中醫，正在獲得全球認可。這一范式強調使用飲食成分進行健康維護和疾病預防，旨在最大限度地減少與長期藥物使用相關的潛在不良反應。支持這一概念的是，許多藥用植物已顯示出抗炎、抗癌和緩解COVID-19后綜合征的特性。事實上，飲食干預已被證明能有效管理多種疾病。例如，生酮飲食用于腎臟疾病、精神疾病和中老年人群心血管疾病。這種方法對消化 disorders特別相關，是全球最普遍的健康問題之一。值得注意的飲食策略包括地中海飲食用于兒科胃腸道問題，特定碳水化合物操作用于功能性疾病，以及無麩質飲食用于炎癥性腸病（IBD）。

薏苡種子是一種有充分文獻記載的藥用和食用植物，在傳統飲食和醫學中已使用數百年。現代證據證實其生物活性化合物的抗癌、抗炎、抗氧化和降血糖活性，支持這種歷史用途。特別是從薏苡中分離的特定生物活性成分薏苡素已顯示出顯著的抗炎特性和低細胞毒性。鑒于薏苡L.種子成分已確立的抗炎功效，我們假設從中衍生的一類新型生物活性納米顆粒——薏苡種子來源外泌體（CLS-Exos）可能保留并傳遞這些治療特性。因此，我們推測CLS-Exos代表一種有前景的新型潰瘍性結腸炎治療候選物。我們的結果表明，CLS-Exos通過顯著下調關鍵促炎細胞因子（包括TNF-α、IL-6和IL-1β）的表達來改善潰瘍性結腸炎。據我們所知，本研究首次報道CLS-Exos的成功提取及其在UC管理中的治療應用。總之，這些發現確立CLS-Exos作為一種有前景和有效的UC治療劑。CLS-Exos的提取及其對UC的影響如圖1所示。

3.1. CLS-Exos的表征

對CLS-Exos的理化性質進行了全面表征。動態光散射（DLS）顯示平均 hydrodynamic直徑為157±2.828 nm，zeta電位為-0.098±0.262 mV（圖2A-B）。雖然近中性zeta電位可能表明合成納米顆粒的不穩定性，但低多分散指數（PDI為0.13）表明單分散分布，暗示在測量條件下的膠體穩定性。這種現象與生物衍生納米顆粒一致，可能歸因于其復雜的表面組成和儲存緩沖液的離子強度。透射電子顯微鏡（TEM）形態學檢查證實存在均勻的杯狀囊泡，直徑約為150 nm（圖2C）。納米顆粒跟蹤分析（NTA）證實了尺寸分布并提供了顆粒濃度數據（圖2D）。

通過多個獨立批次驗證了提取方案的重現性（圖2N）。代謝組學分析在CLS-Exos中鑒定出36種不同的脂質種類（圖2E），主要包括甘油三酯（TG，22.5%）、神經酰胺（CER，13.1%）、己糖基神經酰胺（Hex1Cer，8.7%）和心磷脂（CL，9.7%）（圖2F）。小RNA測序顯示CLS-Exos miRNAs中存在長度依賴性核苷酸偏倚（圖2G-H）。較短的miRNA（18-20 nt）富含鳥嘌呤（G:23-25%），而較長的種類（22-25 nt）主要含有腺嘌呤（A:28-32%）和尿嘧啶（U:26-30%）。胞嘧啶（C）在所有長度中均代表性不足（<20%）。值得注意的是，miR-159家族成員，特別是csi-miR159a-3p和gma-miR159e-3p，在表達最高的10種miRNA中占總TPM標準化讀數的22-35%（圖2I）。miRNA表達譜表現出樣品特異性異質性（圖2J）。

CLS-Exos1顯示雙峰分布，具有明顯的低表達（中值TPM:120）和高表達（中值TPM:280）群體，表明潛在的功能特化或選擇性包裝。CLS-Exos2顯示右偏單峰分布（中值TPM:95），而CLS-Exos3表現出緊密聚集的譜（中值TPM:130），共同表明95-280 TPM的表達范圍。功能注釋顯示跨數據庫（Port、Pram、GO和EggNOG）的多樣化基因映射，KEGG通路中的注釋較少（圖2K）。脂質碳鏈分析顯示雙峰分布，在C16（120±15種脂質）和C18（140±12種脂質）處達到峰值（圖2L），突出了對膜完整性至關重要的棕櫚酸和硬脂酸衍生物的豐度。通過BCA測定確定的蛋白質濃度為12.54μg/mL（圖2M）。

3.2. CLS-Exos的生物相容性

通過細胞毒性和血液相容性測定評估CLS-Exos的生物安全性。使用MTT測定在RAW264.7和NCM460細胞上評估細胞毒性。根據ISO 10993-5標準，當細胞活力超過70%時，材料被認為是非細胞毒性的。我們的結果證實，即使在最高濃度的CLS-Exos（3.04×1010顆粒/mL）下，兩種細胞系的活力仍保持在該閾值以上（圖3B）。

通過將小鼠紅細胞與各種濃度的CLS-Exos孵育來評估血液相容性（圖3C）。在治療組中未觀察到顯著溶血。定量而言，所有CLS-Exos濃度的溶血率保持在5%以下，這是生物材料廣泛接受的安全限度。這與陽性對照（0.1% Triton X-100）誘導的完全溶血和陰性對照（PBS）的可忽略背景形成鮮明對比。這些集體發現證明CLS-Exos的優異生物相容性。

為了進一步評估CLS-Exos給藥的體內安全性概況，在C57BL/6小鼠中進行了全面的系統評估。在適應期后，給小鼠施用CLS-Exos，之后收集血液和主要器官進行分析。血液生化分析（圖3D）和全血細胞計數（圖3E-K）。初步安全性評估顯示，盡管與對照組相比某些參數觀察到微小變化，但所有值仍在既定的生理正常范圍內，表明沒有臨床顯著毒性。組織病理學檢查進一步證實CLS-Exos的生物安全性。對心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟等重要器官的蘇木精和伊紅（H&E）染色顯示與對照小鼠組織相比沒有結構損傷、炎癥浸潤或其他病理改變的證據（圖3L）。總之，血液學、生化和組織病理學分析的結果表明CLS-Exos在體內表現出良好的安全性。

3.3. CLS-Exos對ROS和NO的清除能力

使用DCFH-DA熒光探針在H?O?刺激的RAW264.7巨噬細胞和NCM460細胞中評估CLS-Exos的活性氧（ROS）清除能力。在用H?O?誘導氧化應激之前，用不同濃度的CLS-Exos預處理細胞。熒光顯微鏡成像顯示CLS-Exos預處理以劑量依賴性方式有效減弱H?O?誘導的兩種細胞類型中的ROS生成，較高濃度的CLS-Exos表現出優異的ROS清除活性（圖4B-C）。這種定性觀察通過定量圖像分析得到證實。與表現出最強熒光信號的陽性對照（僅H?O?組）相比，CLS-Exos處理組的熒光強度顯著降低（圖4D-E）。這些結果共同證明CLS-Exos的強效抗氧化活性。

在LPS刺激的RAW264.7巨噬細胞中評估CLS-Exos抑制一氧化氮（NO）產生的能力。CLS-Exos處理以劑量依賴性方式顯著抑制LPS誘導的NO釋放（圖4F）。與NO結果一致，培養上清液的酶聯免疫吸附測定（ELISA）顯示CLS-Exos深刻調節關鍵炎癥介質的分泌。具體而言，促炎細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的產生以劑量依賴性方式顯著抑制（圖4G-I）。

3.4. CLS-Exos對腸上皮細胞修復的影響

劃痕實驗表明CLS-Exos以濃度和時間依賴性方式顯著增強NCM460腸上皮細胞的遷移（圖5A-B）。與對照相比，CLS-Exos處理組的傷口閉合率顯著更高，在最高濃度下觀察到最明顯的效果。這些結果表明CLS-Exos有效促進腸上皮的恢復，表明它們可能促進炎癥誘導的黏膜損傷修復的關鍵機制。

3.5. 口服CLS-Exos在DSS誘導的潰瘍性結腸炎中的治療效果

建立右旋糖酐硫酸鈉（DSS）誘導的小鼠模型以評估CLS-Exos對潰瘍性結腸炎（UC）的治療效果。給小鼠隨意飲用含3% DSS的水7天以誘導結腸炎，然后在第8天恢復正常飲水。在第8至14天，治療組小鼠每天口服不同濃度的CLS-Exos懸浮液，而對照組接受磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）。

在整個實驗期間監測體重作為關鍵疾病參數。與健康空白對照相比，DSS模型對照組表現出顯著體重減輕。相反，所有CLS-Exos處理組以劑量依賴性方式顯示DSS誘導的體重減輕顯著減輕（圖6B）。高劑量CLS-Exos組顯示最明顯的保護作用，體重軌跡與模型對照組相比顯著接近正常水平。

使用疾病活動指數（DAI）定量評估疾病活動。如圖6C所示，DSS模型對照組表現出最高DAI評分，而健康空白對照組在整個研究期間保持最低評分。CLS-Exos處理導致疾病嚴重程度的劑量依賴性改善，高劑量組顯示DAI評分接近健康對照組，低劑量組顯示中等保護。

我們進一步評估了對器官重量和結腸形態的影響。主要器官（心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟）的分析顯示CLS-Exos處理以濃度依賴性方式減輕DSS誘導的器官重量變化，治療組的器官重量介于健康對照組（最高重量）和DSS模型對照組（最低重量）之間（圖6D-H）。

作為結腸炎嚴重程度的關鍵指標，結腸長度評估顯示平行趨勢（圖6I）。DSS模型組表現出顯著的結腸縮短、壁增厚和隱窩結構喪失。這些病理變化通過CLS-Exos處理顯著改善，特別是在高劑量組，其維持的結腸長度和結構與健康對照組相當（圖6J）。總之，這些發現表明CLS-Exos對DSS誘導的潰瘍性結腸炎具有強效、劑量依賴性的治療效果。

3.6. CLS-Exos治療后體內炎癥因子表達

通過H&E染色對結腸組織進行組織病理學分析，以評估黏膜損傷程度和CLS-Exos的治療效果（圖7A）。與空白對照組中觀察到的健康結構相比，3% DSS誘導模型組的結腸切片顯示嚴重的病理改變，包括廣泛的炎癥細胞浸潤、隱窩扭曲和喪失，以及杯狀細胞耗竭。

CLS-Exos處理對這些DSS誘導的組織病理學損傷具有濃度依賴性保護作用。高劑量CLS-Exos組顯示結腸結構幾乎完全保存，炎癥浸潤最小，隱窩維持良好。杯狀細胞的定量證實了這種修復效果，其顯示與施用的CLS-Exos濃度顯著正相關（圖7B）。相反，低劑量組顯示與DSS模型對照組相似的組織學特征，表明低濃度時療效有限。

為了闡明CLS-Exos在結腸炎中的治療機制，我們分析了全身和局部炎癥反應。ELISA血清分析顯示CLS-Exos處理顯著調節關鍵炎癥細胞因子的全身水平。DSS模型組表現出最高濃度的促炎細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β，而CLS-Exos給藥導致其水平的劑量依賴性降低，接近健康對照組中觀察到的水平（圖8A-C）。

結腸組織的定量PCR（qPCR）分析在轉錄水平顯示一致變化。促炎介質（TNF-α、IL-1β和IL-6）的mRNA表達隨著CLS-Exos處理以濃度依賴性方式降低（圖8D-F）。相反，抗炎和細胞保護基因（包括IL-10和血紅素氧合酶-1（HO-1））的表達以劑量依賴性方式相應增加（圖8G-H）。總之，這些結果表明CLS-Exos通過全身和局部恢復免疫穩態，有效抑制促炎信號，同時促進抗炎和保護途徑，從而改善實驗性結腸炎。

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