中藥單體Adv Sci-IF14.1 | 廣中醫(yī)團(tuán)隊(duì)揭示連翹酯苷E靶向進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化減輕肝損傷機(jī)制

目前針對(duì)膿毒癥相關(guān)肝損傷的治療策略主要依賴于抗生素治療和支持性護(hù)理，但其在從根本上逆轉(zhuǎn)炎癥反應(yīng)和代謝失調(diào)方面效果有限。天然產(chǎn)物通過多種機(jī)制在治療炎癥方面發(fā)揮著重要作用，尤其在調(diào)節(jié)炎癥通路、抑制氧化應(yīng)激以及平衡免疫反應(yīng)方面展現(xiàn)出顯著潛力。例如，去亞甲基小檗堿能夠通過抑制NF-κB和MAPK信號(hào)通路來(lái)減輕肝臟炎癥，并且還能通過抑制肝星狀細(xì)胞的激活發(fā)揮抗纖維化作用。 因此，探索具有多種作用機(jī)制的天然藥物已成為一個(gè)新的研究方向。連翹，一種經(jīng)典的傳統(tǒng)中藥（TCM），具有廣譜的抗炎和免疫調(diào)節(jié)特性，其連翹酯苷（如連翹酯苷A、B）顯示出良好的保肝療效。 然而，目前的藥理學(xué)研究主要集中在連翹酯苷 A 和 B 上，而連翹酯苷 E（FE）的抗炎機(jī)制尚未完全明了。

2025年11月14日，廣州中醫(yī)藥大學(xué)張帆/劉中秋/王彩艷教授團(tuán)隊(duì)在Adv Sci（IF 14.1）發(fā)表題為“Forsythoside E Alleviates Liver Injury by Targeting PKM2 Tetramerization to Promote Macrophage M2 Polarization”的文章。FE 介導(dǎo)的 PKM2 四聚體化誘導(dǎo)了巨噬細(xì)胞的代謝重編程，同時(shí)抑制 STAT3 的磷酸化，從而減少 NLRP3 的轉(zhuǎn)錄激活，減輕膿毒癥引起的肝臟損傷。

摘要

膿毒癥引發(fā)的肝臟損傷與膿毒癥患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。在本研究中，通過包括高通量虛擬篩選、靶點(diǎn)捕獲技術(shù)以及原子力顯微鏡（AFM）分析在內(nèi)的綜合方法，連翹酯苷E（FE）首次被確認(rèn)為一種新型的丙酮酸激酶 M2（PKM2）的別構(gòu)激活劑，能夠促進(jìn)四聚體的形成。通過構(gòu)建突變蛋白并結(jié)合動(dòng)態(tài)光散射（DLS）和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)，發(fā)現(xiàn) FE 與 PKM2 的 K311 結(jié)合，從而促進(jìn)四聚體的形成。利用Seahorse XF 代謝分析儀、實(shí)時(shí)單細(xì)胞多模式分析系統(tǒng)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn) FE 介導(dǎo)的 PKM2 四聚體化在巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)代謝重編程，同時(shí)抑制 STAT3 的磷酸化以及隨后的 NLRP3 轉(zhuǎn)錄激活。體內(nèi)評(píng)估表明，F(xiàn)E 未表現(xiàn)出明顯的多器官毒性。FE 通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞向 M2 抗炎表型的極化來(lái)減輕膿毒癥引發(fā)的肝臟損傷。通過在小鼠體內(nèi)特異性過表達(dá)具有 WT/K311A 突變的 PKM2 基因，進(jìn)一步驗(yàn)證了 FE 的作用機(jī)制。綜合來(lái)看，本研究闡明了 FE 通過靶向 PKM2 四聚體化來(lái)減輕膿毒癥相關(guān)肝損傷的分子機(jī)制，并提出了針對(duì)膿毒癥相關(guān)肝損傷治療的創(chuàng)新性代謝-表觀遺傳協(xié)同調(diào)節(jié)策略。

虛擬篩選用于獲得促進(jìn)PKM2四聚化的潛在化合物

為了找到能夠抑制PKM2二聚體形式并促進(jìn)其四聚化的小分子化合物，采用基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選策略，針對(duì)PKM2的激動(dòng)劑結(jié)合位點(diǎn)篩選了超過30,000個(gè)小分子化合物（圖 2B）。根據(jù)對(duì)接評(píng)分，最終選擇了前四種化合物（圖 2C）。分子結(jié)合構(gòu)象與蛋白質(zhì)的視覺檢查顯示，所有四種化合物都可以與PKM2的激動(dòng)劑結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。蛋白質(zhì)的A鏈和B鏈分別用藍(lán)色和綠色卡通結(jié)構(gòu)表示，黃色虛線表示氫鍵（圖 2D）。

雙探針靶點(diǎn)垂釣及相互作用實(shí)驗(yàn)證實(shí)FE直接靶向PKM2

為了進(jìn)一步確認(rèn)FE是否直接靶向PKM2，我們通過添加生物素標(biāo)簽和光親和標(biāo)簽對(duì)FE進(jìn)行化學(xué)修飾(圖 4A)，并進(jìn)行了靶標(biāo)捕獲實(shí)驗(yàn)(圖 4B)。銀染顯示在55到70 kDa之間有一個(gè)明顯的條帶(圖 4C)，LC-MS分析鑒定出與PKM2相關(guān)的肽段(圖 4D)。隨后的 pull-down 實(shí)驗(yàn)證明生物素標(biāo)簽的FE可以直接結(jié)合到PKM2蛋白(圖 4E)。同樣，光親和標(biāo)簽的FE也能夠捕獲PKM2蛋白(圖 4F–H)。免疫熒光結(jié)果顯示FE在細(xì)胞質(zhì)中與PKM2共定位(圖 4I) 與 FE 相比，兩種探針抑制了 iNOS 蛋白的表達(dá)水平，表明這兩個(gè)標(biāo)簽沒有影響 FE 的抗炎效果 (圖 4J)。此外，CETSA 和 DARTS結(jié)果表明，F(xiàn)E 顯著增強(qiáng)了 PKM2 蛋白的穩(wěn)定性 (圖 4K,L)。為了進(jìn)一步評(píng)估 FE 與 PKM2 蛋白之間的結(jié)合親和力，我們進(jìn)行了SPR 實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，PKM2 與 FE 之間的結(jié)合親和力為 277 nM，表明 FE 可以直接且有效地結(jié)合到 PKM2 上 (圖 4M)。分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果表明，F(xiàn)E 結(jié)合到 PKM2 四聚體上減少了 RMSD 和 RMSF，表明 FE 增強(qiáng)了 PKM2 四聚體的穩(wěn)定性 (圖 4N,O這些研究結(jié)果共同證實(shí)，F(xiàn)E 直接靶向并結(jié)合 PKM2。

PKM2 K311 是調(diào)節(jié) FE 結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸

為了進(jìn)一步確認(rèn)FE在PKM2蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)，基于FE和PKM2之間的分子對(duì)接結(jié)果，我們假設(shè)PKM2的K311可能是關(guān)鍵的氨基酸。PKM2 K311的保守性分析顯示，這個(gè)位點(diǎn)在多種物種中是保守的(圖 5A,B)。將這個(gè)位點(diǎn)突變成丙氨酸并獲得重組蛋白后，我們進(jìn)行了CETSA實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，與野生型（WT）蛋白相比，F(xiàn)E無(wú)法有效提高突變蛋白的熱穩(wěn)定性(圖 5C)。我們?cè)诩?xì)胞中過表達(dá)了PKM2 WT和PKM2 K311A蛋白，并檢查了PKM2的多聚形式。結(jié)果表明，F(xiàn)E無(wú)法有效增加PKM2 K311A四聚體的表達(dá)(圖 5D). 為了進(jìn)一步評(píng)估該突變是否削弱了FE和PKM2的結(jié)合，AFM顯示FE和PKM2 K311A之間的結(jié)合力顯著降低（圖5E–H）。同時(shí)，MST結(jié)果表明，F(xiàn)E與PKM2 K311A結(jié)合的KD值顯著高于PKM2 WT（圖5I,J）。DLS結(jié)果表明，F(xiàn)E有效增大了PKM2 WT的顆粒尺寸（圖5K），F(xiàn)RET實(shí)驗(yàn)確認(rèn)FE促進(jìn)了PKM2 WT的聚集（圖5M）。然而，這些效應(yīng)在PKM2 K311A中未觀察到（圖5L,N），表明該位點(diǎn)的突變降低了FE促進(jìn)PKM2四聚體化的能力。分子動(dòng)力學(xué)模擬顯示，F(xiàn)E沒有減少PKM2 K311A四聚體的RMSD和RMSF（圖 5O,P）。這些結(jié)果共同證明PKM2 K311介導(dǎo)FE與PKM2的結(jié)合。

結(jié)論

本研究系統(tǒng)地闡明了FE通過PKM2 tetramerization介導(dǎo)的代謝重編程和表觀遺傳調(diào)控的雙重機(jī)制緩解膿毒癥引起的肝損傷的機(jī)制。這不僅為FE的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，還為針對(duì)免疫代謝調(diào)節(jié)的膿毒癥治療策略開辟了新的途徑

https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202514514

中醫(yī)藥基礎(chǔ)科研技術(shù)服務(wù)及加群交流：

相關(guān)咨詢，加微信：1278317307。

【福利時(shí)刻】科研服務(wù)（點(diǎn)擊查看）：、、、、、。咨詢加微信：1278317307。