【文獻學習】成人腦膠質瘤顱外轉移的臨床、影像學及分子特征分析

研究背景與目的

成人腦膠質瘤是中樞神經系統最常見的原發性惡性腫瘤，其中膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）最常見且惡性程度最高，中位總生存期僅14.6個月。其治療面臨化療耐藥、浸潤性生長等多重挑戰，而膠質母細胞瘤的顱外轉移較為罕見（發生率0.4%-0.5%），其臨床特征、生物學機制及腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）的特征仍缺乏系統認知。

在生理層面，血腦屏障、硬腦膜等生理屏障理論上可阻止腫瘤細胞擴散，但臨床已觀察到20%-39%的GBM患者存在循環腫瘤細胞，且有膠質母細胞瘤通過器官移植傳播的案例。外科干預（如神經外科開顱手術、腦室腹腔分流術）被推測為潛在轉移誘因，但無手術史患者的轉移案例也提示腫瘤自身具備轉移潛能。此外，傳統研究多依賴免疫組織化學（IHC），且局限于個案分析，全基因組DNA甲基化譜等前沿技術在膠質瘤轉移研究中應用極少，TME中免疫細胞與腫瘤干細胞樣細胞的作用亦未明確。

基于上述研究空白，本研究旨在通過多種技術（NGS、全基因組甲基化、RNA測序、IHC等），對迄今規模最大的成人轉移性膠質瘤隊列進行分析，以闡明轉移灶的克隆起源、表觀遺傳、轉錄及TME特征，為臨床診斷與治療提供依據。

材料與方法

1.患者隊列與樣本

本研究初始納入20例成人轉移性膠質瘤，排除2例組織樣本不足及2例非轉移腫瘤（腦脊液播散、通過腦室腹腔分流管播散）后，最終納入16例患者（1999-2019年，丹麥哥本哈根大學醫院），包括14例GBM（IDH野生型，WHO4級）及2例低級別膠質瘤（1例IDH突變星形細胞瘤，WHO 2-3級；1例IDH突變，1p/19q缺失少突膠質細胞瘤，WHO 2-3級）。樣本類型為配對的福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織：原發腫瘤、顱內復發腫瘤（優先最新的復發腫瘤，2例因原發腫瘤不足用首次復發腫瘤替代）、轉移灶（5例手術切除，2例尸檢獲取）。2名神經病理學家按2021年WHO中樞神經系統腫瘤分類重新評估，必要時補充膠質纖維酸性蛋白（GFAP）染色驗證。

2.研究技術與方法

（1）影像學評估

分析原發腫瘤以及轉移腫瘤的MRI影像，包括T1增強、T2、FLAIR序列。分析強化模式、中央壞死、FLAIR/T2不匹配現象、腫瘤占位效應與體積。并評估腫瘤與硬腦膜、腦室、大血管的距離，以探究轉移途徑。

（2）分子檢測

包括DNA提取、二代測序（NGS）、全基因組DNA甲基化譜（Illumina Infinium MethylationEPIC（850K）芯片檢測）、RNA測序，具體細節詳見原文。

研究結果

1.臨床特征

轉移部位分布：轉移至頭皮/上頸部8例（50%）、淋巴結轉移5例（31.25%）、骨轉移2例（12.5%）、肝轉移1例（6.25%）【圖1A】。8例頭皮/上頸部轉移中6例存在顱內病灶經顱骨鉆孔延伸至顱外現象，此類腫瘤非真性轉移。其余10例為真性轉移（原發灶與轉移灶無解剖連接）【圖1B】。

圖1：患者特征概述。（A）轉移部位概述；（B）MRI掃描（T1增強）顯示強化腫瘤通過開顱術鉆孔延伸，伴顱外強化腫瘤（箭頭）（左）；遠處脊柱骨性轉移伴硬膜外壓迫（箭頭）（平掃）（右）；（C）Kaplan-Meier曲線顯示膠質母細胞瘤患者的總生存期，其中包括真性轉移（8例）和顱外延伸（6例）（log-rank p=0.028）。（顯著性水平p<0.05）。（D）患者疾病發展的時間線，從確診到死亡，包括開顱術時間點（組織病理學報告日期）。

病理亞型：14例GBM中6例表現為肉瘤分化（符合膠質肉瘤GS亞型）。2例低級別膠質瘤均進展至高級別（WHO 3級）。

人口學與生存情況：男12例、女4例，診斷中位年齡為56.5歲（27-65歲）。顱外延伸組開顱手術次數顯著多于真性轉移組（3 vs 2，p=0.0450），且總生存期（OS）更長（17.5 vs 7.5個月，p=0.0288）【圖1C】。GBM患者中位OS為12.5個月（范圍5-44個月），轉移后中位生存期86天（15-200天）；2例低級別膠質瘤OS分別為147個月、35個月【圖1D】。

治療與分子標志物：11例患者初治方案包括放療聯合替莫唑胺化療。GBM中MGMT啟動子甲基化率14%（2/14），低級別膠質瘤中為100%（2/2）。4例GBM存在TERT啟動子熱點突變【表1，詳見原文】。

2.影像學特征

在腫瘤轉移途徑方面，未發現腫瘤與硬腦膜、腦室、大血管的距離與轉移能力的相關性，但6例顱外延伸患者中，5例在手術鉆孔處觀察到異常強化，提示腫瘤沿手術路徑生長。1例顱外延伸患者見顱底強化，但與鉆孔關聯不明確。原發腫瘤影像學均符合高級別膠質瘤典型特征，包括對比增強、中央壞死、FLAIR序列高信號（提示瘤周水腫）；無FLAIR/T2不匹配現象（IDH突變型膠質瘤的特征性標志）；腫瘤體積22.0-104.4cm3，與非轉移GBM體積分布無明顯差異。

3.克隆起源與遺傳特征

本研究對腫瘤的突變譜進行分析，共檢測413個基因的1491個非同義體細胞突變，高頻突變為PIK3CA、EGFR、PTEN、NOTCH1、SMARCA4【圖2A】。未發現DNA損傷修復通路（如錯配修復）突變，亦無微衛星不穩定性（MSI）證據。同源重組通路亦無異常。顱外延伸組的原發腫瘤TMB有升高趨勢，但無統計學意義。

4例腫瘤存在TERT啟動子熱點突變。在13例GBM中，有8例的關鍵拷貝數變異（CDKN2A/B純合缺失、+7/-10染色體異常、EGFR擴增）完全保留【圖2B】。所有患者腫瘤的MGMT甲基化狀態在疾病進展過程中保持穩定。

研究者對6名患者縱向采集的腫瘤樣本的變異等位基因頻率和拷貝數動態變化進行研究，以探索驅動腫瘤進展和轉移的機制。5名患者的顱內復發腫瘤和轉移腫瘤均起源于原發腫瘤。僅有2名患者的顱內復發腫瘤缺乏致癌基因突變【圖2C，詳見原文】。這表明膠質瘤的轉移起源于原發腫瘤。

圖2A-B：轉移性成人膠質瘤的分子特征。（A）Oncoprint圖顯示原發、復發及顱外轉移灶的突變圖譜。每列對應單個樣本，按患者系統排列；y軸列出臨床相關突變基因，不同顏色代表臨床信息和突變功能；（B）通過DKFZ腦腫瘤分類器V.12.5鑒定的差異腫瘤亞群關鍵分子特征。

4.表觀遺傳動態（甲基化譜改變）

甲基化譜分析顯示，68%（21/31）的腫瘤的甲基化類別可以可靠地進行歸類（DKFZ分類器得分≥0.84）。原發GBM中最常見的甲基化類別為GBM_MES型（間質型，43%）與GBM_RTK2型（21%），轉移灶中兩類別的分布比例相似（MES型43%、RTK2型14%）。

平均腫瘤純度15%-92%，原發、復發、轉移灶間無顯著差異。但腫瘤純度與甲基化類別得分顯著相關（R=0.3564，p=0.0490），提示純度可能影響甲基化分類的可靠性。

對所有樣本中變異程度最高的1%的探針進行無監督聚類分析，顯示8/14例患者的甲基化特征呈“患者特異性穩定”（同一患者的不同階段樣本聚類在一起）【圖3A】；另外6例患者的甲基化特征不穩定，其中2例（患者8、15）在進展過程中發生甲基化類別轉變（如從GBM_RTK2轉為GBM_MES）【圖3B】。

研究者在原發灶與轉移灶間共鑒定60724個差異甲基化位點，其中多數（>90%）在轉移灶中呈低甲基化，提示腫瘤進展過程中存在全基因組DNA甲基化水平的下降。

圖3：原發腦腫瘤、顱內復發灶和轉移灶的全基因組DNA甲基化譜分析。（A）熱圖顯示甲基化特征中變異度前1%探針的無監督層次聚類；（B）Sankey圖顯示DKFZ腦腫瘤分類器V.12.5預測的原發腦腫瘤、顱內復發灶和顱外轉移灶的甲基化分類。

5.RNA測序揭示腫瘤進展過程中的亞型轉換

對5例GBM的ssGSEA分析顯示，2例原發腫瘤為經典亞型，在復發和轉移中轉變為間質亞型。1例不能獲得原發腫瘤，以第一次復發腫瘤代替。該腫瘤在進展過程中保持經典亞型特征。相反的是，2例原發腫瘤為間質亞型，1例轉移病灶保持了間質亞型，另1例的復發病灶為經典亞型，轉移病灶又轉換為間質亞型。這說明轉錄亞型存在動態的轉換【圖4A，詳見原文】。

為探索真性轉移病灶和顱外延伸病灶是否由不同的轉錄程序激活，研究者對真性轉移和顱外延伸組的原發腫瘤【圖4B，詳見原文】以及復發、轉移腫瘤【圖4C，詳見原文】進行ssGSEA分析。真性轉移組的原發腫瘤中上皮-間質轉化（EMT）通路激活程度顯著更高（p<0.05），另外TGFβ信號傳導、γ干擾素反應、IL2-STAT5信號等炎癥相關通路激活。綜上，進展和轉移過程中存在轉錄可塑性以及RNA亞型轉換的證據。

6.腫瘤干性特征保持穩定

基于甲基化干細胞特性估計值以及細胞標志物（SOX2、OLIG2）和神經元標志物MAP2的的IHC結果顯示，在進展及轉移過程中干細胞特性未顯示出差異。這表明腫瘤的干細胞特性并非GBM發生轉移的關鍵驅動因素。

7.腫瘤微環境（TME）特征

腫瘤微環境被認為與轉移的發生有關。細胞類型解卷積顯示，原發和轉移腫瘤中均以單核細胞來源的細胞為主導；NK細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、單核細胞來源的細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞在疾病變化中水平相似，組間無顯著差異【圖5A】中無顯著變化。僅顱內復發灶中B細胞比例顯著降低（p<0.05）。

通過定量分析免疫細胞標志物以研究免疫細胞組成。結果顯示顯示，CD8+T細胞、FOXP3+調節性T細胞和CD68+巨噬細胞的數量在原發、復發和轉移腫瘤中無顯著變化【圖5B-D，詳見原文】。與顱外延伸組相比，真性轉移組原發腫瘤的CD68 +巨噬細胞水平顯著降低（p=0.01，圖5D），且真性轉移組轉移腫瘤的CD68+巨噬細胞密度低于復發腫瘤（p=0.04）。

8. GFAP表達變化

與原發腦腫瘤相比，所有轉移灶中GFAP表達顯著降低或完全缺失，2例低級別膠質瘤轉移灶亦呈現相同模式。這說明腫瘤進展會導致星形膠質細胞樣分化的喪失。

圖5A：小提琴圖和比例圖顯示原發腫瘤和轉移灶中B細胞、NK細胞、CD4?T細胞、CD8?T細胞、單核細胞衍生細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞的細胞類型反卷積比例。中位數以水平線顯示，第25和75百分位數以虛線水平線顯示。患者3和13的原發腫瘤無細胞類型反卷積數據，比例圖中顯示為空白柱。

討論與結論

本研究證實，成人膠質瘤可出現真性的顱外轉移，以及向顱外延伸。顱外延伸組的預后相對較好。由于復發膠質母細胞瘤需要更多開顱手術治療，增加了向顱外延伸風險。值得關注的是，有2例存在頭皮病灶患者，最初被認為真性轉移。但進一步影像學檢查提示頭皮腫瘤均靠近顱骨鉆孔，因此可以用沿手術路徑種植來解釋。另外腫瘤通過腦膜淋巴管擴散也可能是轉移途徑之一。

本研究對轉移性膠質母細胞瘤的MRI特征特征進行分析，發現諸多與轉移性膠質母細胞瘤顯著相關的典型征象，如不均勻強化、中央壞死及明顯占位效應等，這些表現與膠質母細胞瘤已確立的影像學表現一致，常表現為血腦屏障破壞以及壞死核心被周圍存活的腫瘤組織環繞。腫瘤體積范圍廣泛，與文獻中報道的非轉移性膠質母細胞瘤體積情況相符，這表明腫瘤體積并不影響其轉移潛能。

通過對連續腫瘤樣本進行突變分析，在5名患者中發現原發腫瘤是轉移腫瘤的克隆起源，且復發和轉移瘤是平行演化的。甲基化譜分析顯示，至少有2例膠質母細胞瘤在轉移過程中發生了甲基化類別轉變。此前已有研究表明，膠質母細胞瘤在復發時可能會發生甲基化類別轉變，而本研究首次表明這種轉變也可能發生在轉移過程中。在腫瘤進展和轉移過程中存在全基因組DNA甲基化水平的下降，仍需進一步研究這一現象在膠質母細胞瘤轉移中的作用。另外腫瘤進展及轉移過程中存在亞型的動態轉換，盡管樣本量有限，但總體趨勢是向間質亞型轉變。

在真性轉移瘤中，上皮-間質轉化（EMT）通路被激活的現象更顯著，這可能表明EMT通路的激活在真性轉移瘤的發展中起著重要作用。同樣的分析還顯示，在發生真性轉移的患者中，各種免疫反應通路的表達上調，盡管樣本量有限無法得出確切結論，但這可能意味著與顱外延伸相比，真性轉移時免疫微環境的參與更為積極。

關于干細胞特性的分析中，基于甲基化的干細胞指數以及對細胞標志物OLIG2和SOX2的定量檢測結果均顯示，原發、復發和轉移瘤之間無顯著差異。研究結果表明，干細胞特性并非膠質母細胞瘤轉移進程迄今為止的驅動因素。

至今為止，尚無研究分析膠質母細胞瘤轉移病灶的免疫微環境與原發腫瘤的差異。本研究發現原發腫瘤和繼發腫瘤的免疫細胞組成驚人地相似。因此，廣為接受的“免疫豁免腦”這一概念似乎并不適用于發生轉移的膠質母細胞瘤。不過，出現顱外延伸的患者原發腫瘤中CD68+巨噬細胞的水平高于真性轉移。鑒于巨噬細胞可促進腫瘤細胞遷移，可以推測它們可能參與了向顱外延伸的過程。

本研究結果表明上皮間質轉化參與了膠質瘤的轉移。多個轉移灶GFAP的表達降低，這反映了腫瘤進展過程中星形膠質細胞樣分化的喪失。本研究的甲基化分析表明甲基化類別向間質亞型轉變，顯示膠質瘤在發展和轉移過程中在表觀遺傳水平上具有可塑性。在轉錄水平上也觀察到了同樣的模式。我們的隊列中還包含異質性多的膠質肉瘤，我們推測這種亞型特有的間質成分增加了轉移的可能性。

總之，本研究證明原發腫瘤是膠質瘤轉移病灶的克隆起源。膠質瘤向顱外延伸與真性轉移是不同的。另外腫瘤發展過程中存在表觀遺傳和轉錄亞型的可塑性。而腫瘤微環境中的免疫細胞成分不受轉移部位的影響，這表明未來針對膠質瘤的腫瘤微環境導向療法可能對轉移灶也有效。

參考資料：Clinical, radiological, and molecular insights into extracranial metastases from adult gliomas. Neuro-Oncology,2025. doi:10.1093/neuonc/noaf178

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