《食品科學》：南昌大學李俶教授等：高能流體磨增溶大豆蛋白的作用機制

與動物蛋白相比，植物蛋白因其具有來源廣泛、價格低廉、生態友好等優勢，受到越來越多消費者追捧。大豆蛋白作為一種常見的植物蛋白，具有良好的營養價值以及多種獨特的功能性質，對改善食品的感官和品質有較好作用。蛋白質溶解度是評價其加工價值的一個重要參數。大豆蛋白在生產加工過程中的溶解性較差。

大豆蛋白的常用修飾方法包括物理修飾法、化學修飾法、酶修飾法和生物工程修飾法，其實質是通過改變蛋白質的結構改善蛋白質的理化、功能特性。動態微射流作為一種新型的物理修飾方法，與其他物理修飾方法相比，具有營養成分損失小、加工時間短等優勢。但前期大量的研究工作已經清晰地認識到傳統微射流技術在改性食品大分子和加工方面的局限。因此本團隊基于20余年對動態高壓微射流（DHPM）技術的研究基礎和DHPM在改性食品大分子方面的大量工作，通過創新微射流的核心技術成功創制了高能流體磨（HEFM）設備（圖1），其兩大主要部件為三柱塞高壓往復泵和高速渦流動能反應腔。本課題組前期的研究則表明HEFM處理豌豆蛋白后，其溶解度能夠從16.99%提高到64.28%。由此可知HEFM技術在提高植物蛋白溶解度方面具有較大潛力，其增溶機制值得進一步探究。

南昌大學食品科學與資源挖掘全國重點實驗室的朱啟銘、陳軍、李俶*等以大豆蛋白作為研究對象，探究HEFM對大豆蛋白的增溶效果，并進一步從顆粒特性（粒徑、電位和微觀結構）和結構變化的角度明晰HEFM增溶大豆蛋白的作用機制，以期提供一種制備高濃高溶大豆蛋白的工業化方法。

1 HEFM處理對大豆蛋白溶解度的影響

蛋白質的溶解度是一項關鍵的功能特性，它直接影響蛋白溶液的外觀以及乳化、發泡等其他功能特性。如圖2A所示，當HEFM處理壓力為30、60、90、120 MPa時大豆蛋白的溶解度分別為64.40%、73.03%、75.13%和76.97%，較未處理的大豆蛋白（30.76%）提高了1 倍多。圖2B為各組大豆蛋白溶液靜置1 d后的狀態，未經處理的大豆蛋白溶液出現了明顯的分層現象，而經HEFM處理后的樣品均未分層，表明HEFM技術大大增加了大豆蛋白的溶解度。與大豆蛋白大部分常規改性手段相比，HEFM改性不僅操作簡單、耗時短，而且效果更好。基于前期對HEFM改性豌豆蛋白機理的探究可以進行一個關于大豆蛋白改性機理的初步推測，即在HEFM處理過程中大豆蛋白受到強大的剪切、高速沖擊、瞬時壓降和空化力以及額外熱效應的影響，可能改變了其結構（如破壞形貌、減小粒度、蛋白去折疊等），從而達到增溶的目的。

2 HEFM處理對大豆蛋白粒徑及其分布的影響

蛋白質懸浮液中膠體顆粒粒徑會影響其溶解度，因為它會影響其重力。圖3A展示了大豆蛋白粒徑分布隨壓力的變化，未經HEFM處理的大豆蛋白的粒徑分布呈現一個寬的單峰，經30 MPa壓力處理后，粒徑分布曲線左移，呈現亞微米和微米級雙峰分布。且隨著處理壓力的增加，樣品的亞微米峰面積逐漸增大，微米峰面積逐漸減小。這一結果表明，HEFM處理有效地將大豆蛋白的顆粒尺寸減小到亞微米級。如圖3B所示，隨著處理壓力的增加（0～120 MPa），D[3,2]從46.53 μm降低到0.48 μm，D[4,3]從94.90 μm降低到3.65 μm。粒徑的減小可能會增加蛋白質-水相互作用，這可能是改善大豆蛋白溶解度的原因之一。通過動態光散射進一步表征了大豆蛋白上清液的Z-平均粒徑。如圖3C所示，隨著處理壓力的增大，大豆蛋白樣品的Z-平均粒徑先顯著增加后不斷減小。對于粒徑的顯著增加，可能歸因于動態光散射在未處理的大豆蛋白上清液中無法檢測到大的不溶性聚集體，所以在0 MPa時其顯示出較小的Z-平均粒徑。而經過HEFM處理后，大的不溶性聚集體轉變為可溶性聚集體，因此在30 MPa時大豆蛋白的Z-平均粒徑激增。吳佳在使用DHPM處理肌原纖維蛋白時也發現了類似的現象，其認為這可能是因為微射流處理使原本緊緊纏繞的蛋白結構展開，當壓力較小時，不足以將蛋白破碎成更小的顆粒，因此其粒徑有所增加；而隨著壓力增大，聚集體結構發生解聚，粒徑變小。此外，大豆蛋白的PDI隨著處理壓力的增加而逐漸降低（圖3C）。當壓力增加到120 MPa時，PDI達到最低值（0.28），這說明懸浮液中的大豆蛋白顆粒在HEFM處理過程中變得更加均勻。總之，顆粒粒徑和PDI的減小可能有助于形成更加穩定的大豆蛋白分散體。

3 HEFM處理對大豆蛋白Zeta電位的影響

Zeta電位用于表示蛋白質溶液的表面電荷和穩定性，Zeta電位的絕對值越大，表明蛋白質分子之間的靜電相互作用越強，在溶液中的分散穩定性越好。如圖3D所示，經HEFM處理后，不同處理壓力下大豆蛋白Zeta電位的絕對值均顯著高于未處理組。且隨著處理壓力上升（0～120 MPa），大豆蛋白電位絕對值從18.40 mV增加到28.03 mV，蛋白質聚集體進一步被破壞，使得更多帶電側鏈暴露到表面，增強了蛋白質之間的靜電斥力，靜電斥力越大，不穩定聚集的現象越不容易發生，從而提高了蛋白質的穩定性。Cheng Miaomiao等也發現了類似的結論，其研究結果表明DHPM處理的燕麥分離蛋白電位的絕對值顯著上升，且隨著壓力的增大而繼續上升，燕麥分離蛋白分散體系趨于穩定。

4 HEFM處理對大豆蛋白微觀形貌的影響

為了探究HEFM處理對大豆蛋白微觀形貌的影響，通過掃描電子顯微鏡觀察其處理前后的微觀形貌（圖4）。未處理的大豆蛋白主要呈現為大的聚集體結構。經過HEFM處理后，大豆蛋白顆粒的形態發生了明顯變化。在30 MPa壓力下，大豆蛋白聚集體轉變為較小的不規則顆粒狀結構，60 MPa時能觀察到比30 MPa時更小的不規則顆粒狀結構。當壓力增加到90 MPa時大部分蛋白呈現球形顆粒結構，120 MPa時則能夠觀察到最小且最均勻的球形顆粒結構。蛋白質形貌從大的聚集體轉變為小的球形顆粒，證實了HEFM處理后粒徑減小的結果，也與本課題組前期賀小紅和陸云峰等的研究結果一致。大豆蛋白的疏松結構為其在分散過程中接觸水分子創造了更多的機會，從而促進了其溶解度的增加。

5 HEFM處理對大豆蛋白三級結構的影響

蛋白質內部的芳香族氨基酸可以作為鑒定蛋白質三級結構的指標，常利用內源熒光光譜對特定的色氨酸和酪氨酸進行測定，通過熒光光譜強度及波峰的差異來判斷蛋白結構的變化。圖5顯示了未經處理和HEFM處理大豆蛋白的內源熒光光譜。HEFM處理使大豆蛋白的最大吸收波長（λmax）輕微藍移，表明大豆蛋白所處環境由親水性向相對疏水性轉變。這可能是因為高壓破壞了蛋白質內部的疏水相互作用，并使疏水氨基殘基暴露到蛋白質表面。先前的研究也得到了類似的結論，Shen Lan等先將大豆蛋白在95 ℃進行預熱，再進行微流化處理，同樣觀察到了大豆蛋白λmax的藍移，藍移現象可能表明微流化誘導了大豆蛋白的構象重排。此外，使用HEFM對大豆蛋白進行處理后，其熒光信號的峰值強度顯著增加。由圖5可以清晰地看出在30～120 MPa的處理壓力范圍內，隨著壓力的增大，熒光強度逐步增加。這是由于在天然蛋白質中，能產生熒光的芳香族氨基酸被非極性氨基酸包裹，位于分子內部，而隨著處理壓力的升高，蛋白結構進一步展開，處于分子內部的芳香族氨基酸逐漸暴露，更多暴露的芳香族氨基酸將促進分子間疏水相互作用和聚集體的形成而導致水溶性蛋白熒光強度增加。

6 HEFM處理對大豆蛋白表面疏水性的影響

將蛋白質與ANS混合，蛋白質中暴露的疏水基團會與熒光探針相結合，使熒光強度發生變化。在極性環境中，蛋白質表面疏水基團的數量用于表征蛋白質的表面疏水性，它是評價蛋白質構象改變的一個指標。從圖6可以看出，未經處理大豆蛋白的表面疏水性遠低于HEFM處理后大豆蛋白的表面疏水性。且隨著處理壓力的增大，表面疏水性可以由1 559.60增大至7 199.28。賀小紅也發現HEFM處理可以顯著提高豌豆蛋白的表面疏水性，與未處理的豌豆蛋白相比，120 MPa處理壓力下的豌豆蛋白的表面疏水性急劇增加。這可能是因為高壓破壞了較大的蛋白質聚集體，從而使蛋白質內部的疏水基團暴露。同樣在HEFM協同pH值循環處理大米-豌豆復合蛋白的研究中，陸云峰等發現僅經pH值循環處理的大米-豌豆復合蛋白的表面疏水性為4 025.33，而當使用HEFM協同pH值循環處理復合蛋白時，表面疏水性則增長至6 842.50。由此推斷可能是HEFM撞擊腔中的物理作用分散了蛋白顆粒，使顆粒變小的同時蛋白結構也更為舒張，促進了蛋白質疏水區域的暴露，從而提高了蛋白的溶解性。

7 HEFM處理對大豆蛋白巰基和二硫鍵含量的影響

巰基基團和二硫鍵是大豆蛋白中重要的功能基團，其含量變化可反映蛋白的變性程度，對蛋白質功能性質有關鍵的影響。圖7反映了HEFM處理前后大豆蛋白游離巰基、總巰基和二硫鍵含量的變化趨勢。未經處理的大豆蛋白的游離巰基和總巰基以及二硫鍵含量分別為18.87、61.57、21.35 μmol/g，經HEFM處理后，其游離巰基、總巰基和二硫鍵含量總體均呈現上升趨勢。這可能是因為HEFM處理引起了大豆蛋白分子構象伸展，內部巰基基團暴露至表面，導致游離巰基和總巰基含量的增加。同時大豆蛋白分子結構變得越來越無序，促進了巰基向二硫鍵的轉化，因此經過HEFM處理后其二硫鍵含量也顯著上升。處理組中，當壓力由30 MPa上升到120 MPa過程中，游離巰基含量先略微下降后逐漸上升，二硫鍵含量則呈現相反的變化趨勢。游離巰基含量由21.98 μmol/g略微下降至21.45 μmol/g，然后在處理壓力為120 MPa時上升至22.18 μmol/g；而二硫鍵含量則先由28.08 μmol/g略微上升至28.44 μmol/g，然后在處理壓力為120 MPa時下降至26.14 μmol/g。這是因為在低壓環境下的剪切和空化作用加劇了蛋白質分子間的碰撞，促進了游離巰基向二硫鍵的轉變。而當壓力升高到一定水平時，處理強度足以破壞肽鏈內部或分子間的二硫鍵，進而生成新的游離巰基。而總巰基含量則在壓力上升過程中先基本保持不變后逐漸降低，這可能是由于隨著壓力的增大，內部巰基基團逐漸暴露至表面導致了總巰基含量的增加，同時蛋白質顆粒尺寸在逐漸減小，增加了其與氧氣的接觸面積又會促進巰基的氧化，導致總巰基含量降低。在處理壓力不超過90 MPa時，這兩種作用處于平衡狀態，所以總巰基含量基本保持不變。而當壓力繼續增大到120 MPa時，由于內部巰基基團的最大化暴露使總巰基含量不再增加或顆粒尺寸的進一步減小導致氧化程度的加劇打破了這兩種作用的平衡，故總巰基含量呈現下降趨勢。

8 HEFM處理對大豆蛋白二級結構的影響

在圓二色光譜圖中，各種二級結構均會表現出其特定的譜線形狀。由圖8A可以看出，各組大豆蛋白樣品的圓二色光譜曲線在222 nm左右都出現了一個負峰，表明它們的二級結構中均存在α-螺旋結構；在192 nm附近出現一個正峰，同時在215 nm附近有一個負凹槽，表明它們的二級結構中均存在β-折疊結構；在199 nm左右出現了一個負峰，表明它們的二級結構中均存在無規卷曲結構；而在205 nm附近出現了一個正峰，則表明它們的二級結構中均存在β-轉角結構。由此可知HEFM處理沒有改變大豆蛋白二級結構的類型，僅僅造成了不同二級結構含量的變化。因此通過1.3.7節中提及的網站分析處理圓二色光譜相關數據，計算出了HEFM處理前后大豆蛋白各類二級結構相對含量。如圖8B所示，未經處理大豆蛋白的α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲相對含量分別為7.93%、36.27%、22.70%和33.10%。當HEFM處理壓力增大到120 MPa后，大豆蛋白二級結構由β-折疊向α-螺旋轉變，β-折疊相對含量降低到31.23%，α-螺旋相對含量上升到14.73%，β-轉角和無規卷曲相對含量則沒有顯著變化。同樣，張媛通過實驗發現，與未經過高壓均質處理的大豆蛋白相比，經均質處理大豆蛋白的α-螺旋結構含量升高，β-折疊結構含量降低。這說明高壓均質處理使大豆蛋白內部氫鍵結構排列發生改變，構象發生變化，二級結構朝更為親水的方向轉變。涂宗財在研究動態超高壓微射流改性對大豆蛋白結構影響的過程中，也得出了類似的結論。圓二色光譜檢測的結果顯示經動態超高壓微射流處理后，大豆蛋白的α-螺旋相對含量明顯增加，β-折疊與無規卷曲相對含量普遍降低，而β-轉角相對含量則基本上沒有變化。從大豆蛋白二級結構的上述變化來看，動態超高壓微射流的作用使原有維系其螺旋結構的穩定性的氫鍵取向發生改變，削弱了蛋白質的剛性結構，使其穩定性降低，結構更為松散。上述實驗結果也與溶解度變化趨勢相互印證，表明HEFM處理會使得蛋白二級結構發生轉變，有利于蛋白溶解性的改善。

9 SDS-PAGE分析

在還原和非還原條件下，對HEFM處理前后的大豆蛋白進行SDS-PAGE分析，探究HEFM處理對蛋白質一級結構與蛋白質聚集體形成的影響。根據超速離心法中蛋白質沉降系數不同可將大豆蛋白分為2S、7S、11S和15S 4 個不同組分，其中7S和11S所占比例較大。β-伴大豆球蛋白是7S蛋白的主要成分，由α、α′、β 3 種亞基組成。而大豆球蛋白則為11S蛋白的主要成分，由酸性肽鏈A和堿性肽鏈B組成。圖9A為非還原條件下的電泳結果，反映了原始蛋白中的蛋白質與亞基情況。未經處理的大豆蛋白在約17、35、45、50～75 kDa處存在條帶，表明其上清液中存在部分低分子質量的7S和11S蛋白質亞基單體。經過HEFM處理后，電泳條帶顏色變深，這是因為更多的大豆蛋白小分子進入泳道中，表明HEFM處理能夠破壞大豆蛋白聚集體間的二硫鍵，進而提升其溶解度。在還原條件下，大豆蛋白聚集體被解聚成相應的亞基，一般來說具有較低分子質量亞單位的蛋白質具有較高的溶解性，如圖9B所示，HEFM處理后大豆蛋白的α、α′亞基和酸性亞基A條帶顏色變淺，β亞基和堿性亞基B條帶顏色變深，表明大豆蛋白低分子質量亞基含量增加，甚至在120 MPa處理條件下大豆蛋白的所有亞基條帶顏色均變淺，說明隨著壓力進一步提升又形成了分子質量更低的亞基單位。上述結果則進一步解釋了大豆蛋白溶解性提升的原因。

10 HEFM增溶大豆蛋白作用機制推斷

基于上述研究結果，分別從以下2 個層面對HEFM增溶大豆蛋白的作用機制進行推斷，如圖10所示。首先從宏觀層面上來看，商業大豆蛋白在生產過程中通常伴隨著極端的加工條件，導致其嚴重變性，蛋白質會發生高度聚集，進而形成大的不溶性聚集體。而通過掃描電子顯微鏡和粒徑測定的結果可以很直觀地看出HEFM處理能夠使大豆蛋白不溶性聚集體分散破碎，且隨著壓力的增大，粒徑不斷減小，蛋白質形貌轉變為小且均一的球形顆粒，增大了蛋白與水的接觸面積，從而增強了水-蛋白質相互作用的能力，以達到增溶的效果。其次從微觀層面上來看，通過對經HEFM處理的大豆蛋白的SDSPAGE結果進行分析，發現當壓力達到一定程度時，大豆蛋白的分子間就會出現解聚集現象，具體表現為分子質量的降低和亞基的降解，此時基于圓二色光譜的實驗結果推斷出蛋白質分子中的氫鍵等分子間相互作用被破壞，從而削弱了蛋白質的剛性結構，使其穩定性降低，結構變的較為松散。隨著壓力的進一步增加，內源熒光數據顯示高壓破壞了蛋白質分子內部疏水相互作用，結合表面疏水性和巰基相關數據可知原先埋藏于蛋白質分子內部的極性基團（巰基等）和非極性基團（疏水基團等）暴露出來，一方面蛋白質分子顆粒的表面電荷分布加強，蛋白間靜電斥力增加，對蛋白顆粒起到了一定的抗聚集作用，這與電位測定結果一致；另一方面，圍繞著新暴露的極性基團的結合水增多，蛋白質的水化作用增強。在這兩種作用的共同影響下，大豆蛋白的溶解性得到顯著提升。

結論

本研究采用HEFM在不同壓力下處理大豆蛋白，結果發現HEFM處理顯著提高了大豆蛋白的溶解性，HEFM壓力越高，大豆蛋白的溶解性越高，最高可以達到76.97%。改性后大豆蛋白的粒徑分布左移，Z-平均粒徑和PDI下降，電位絕對值增大，說明大豆蛋白分散體系趨于穩定。且隨著處理壓力的增大，大豆蛋白的電泳條帶褪色、熒光強度增大、表面疏水性增加、游離巰基含量上升且分子內（間）二硫鍵被打斷，二級結構向α-螺旋轉變，說明HEFM能夠破壞大豆蛋白的原有結構并使其發生重排，具體表現為其剛性結構減少，柔性結構增加，分子由有序結構變為無序。分子結構的展開與失穩更加有利于不溶性蛋白聚集體解離為可溶性的蛋白顆粒，從而改善大豆蛋白的溶解度。綜上所述，HEFM可以有效地提高商品豆類蛋白質的溶解性，是一種高效的工業化技術，有利于擴大商品豆類蛋白在食品行業中的應用。

作者簡介

通信作者：

李俶 教授

南昌大學食品學院

南昌大學食品學院，教授，博士。

研究方向：天然產物的分離純化，多酚的結構與活性、蛋白質與活性小分子間相互作用。科研成果：近5年來，主持國家自然科學基金3 項。作為主要參與人獲江西省科學技術進步一等獎1 項，在國內外核心期刊發表30余篇文章。開展了江西省地方資源南酸棗的研究，在南酸棗的研究方面，處于國際領先水平，在南酸棗天然產物研究方面發表了10余篇論文。近年來，在多酚的結構與活性以及蛋白質與活性小分子相互作用研究中取得一定的成果。

第一作者：

朱啟銘 碩士研究生

南昌大學食品學院

2022-2025年于南昌大學食品學院就讀碩士研究生。研究方向：植物蛋白改性。

本文《高能流體磨增溶大豆蛋白的作用機制》來源于《食品科學》2025年46卷第8期16-24頁，作者：朱啟銘，陳軍，陳巧云，戴濤濤，鄧利珍，王乙惠，張文慧，李俶。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20241009-033。點擊下方 閱讀原文 即可查看文章相關信息。

實習編輯：陳麗先；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網

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