廣州醫(yī)科大學《自然·通訊》：新型Janus水凝膠：一分鐘止血，防止手術后組織粘連

在臨床實踐中，手術縫合線仍然是處理體內(nèi)損傷最常用的方法。然而，縫合針穿刺不可避免地會造成組織創(chuàng)傷，可能引發(fā)出血、吻合口漏、敗血癥和感染等并發(fā)癥。更嚴重的是，傷口縫合過程中的氧化應激和炎癥可能導致異常組織增生和術后粘連。接受腹部手術的患者發(fā)生術后腹膜粘連的風險極高，這可能導致腸梗阻、器官功能障礙和慢性盆腔疼痛；而接受剖宮產(chǎn)、刮宮術或子宮肌瘤切除術的女性則面臨宮腔粘連的高風險，可能導致不孕。盡管組織粘合劑的發(fā)展為傷口閉合和組織修復提供了新思路，但大多數(shù)粘附性水凝膠由于結(jié)構(gòu)均質(zhì)性而表現(xiàn)出無差別粘附，導致非預期組織附著或鄰近組織間的過度粘連。現(xiàn)有的Janus（雙面）水凝膠雖可通過異質(zhì)結(jié)構(gòu)實現(xiàn)雙側(cè)不對稱粘附，但其制備過程依賴多步復雜工藝，影響重現(xiàn)性并延長加工時間，且多層復合制備方法會削弱水凝膠的機械強度，限制了其臨床轉(zhuǎn)化和規(guī)模化生產(chǎn)。

針對這一挑戰(zhàn)，廣州醫(yī)科大學吳可可教授、張智勇教授和五邑大學吳盼盼副教授合作開發(fā)了一種名為SLAA的一體化高強度Janus水凝膠，通過一步法合成，在5分鐘內(nèi)即可完成凝膠化。該水凝膠具有優(yōu)異的力學性能和顯著的雙側(cè)不對稱粘附特性：其一面可牢固粘附于濕潤組織實現(xiàn)快速止血和傷口封閉，另一面則具有抗粘附性能，能有效防止術后組織粘連。在動物實驗中，該水凝膠作為緊急止血貼片，在大鼠和巴馬豬的多個器官上實現(xiàn)了快速止血；同時，與縫合線和商業(yè)粘合劑相比，它能夠強效單側(cè)粘附受損的腸道和子宮內(nèi)膜組織，促進傷口愈合并減少術后粘連。這種兼具簡便制備、高機械強度和有效不對稱濕組織粘附的Janus水凝膠，為下一代生物粘合劑提供了切實可行的設計方案。相關論文以“One-pot fabrication of high-strength Janus hydrogel for wet tissue hemostasis and intestinal/intrauterine anti-adhesion”為題，發(fā)表在Nature Communications上。

圖1. SLAA Janus水凝膠的制備與應用。 a SLAA Janus水凝膠制備示意圖。（SL：木質(zhì)素磺酸鈉；LMA：甲基丙烯酸月桂酯；PAM：聚丙烯酰胺；PAA：聚丙烯酸）。b SLAA Janus水凝膠用于抗術后粘連、快速止血和組織再生的示意圖。使用BioRender創(chuàng)建。

水凝膠的制備與結(jié)構(gòu)表征

研究人員首先將疏水成分（甲基丙烯酸月桂酯，LMA）和親水成分（丙烯酰胺AM、丙烯酸AA）在單一容器中混合，加入引發(fā)劑進行水凝膠制備。有趣的是，在沒有添加木質(zhì)素磺酸鈉（SL）的情況下，水凝膠前體溶液無法形成凝膠；而加入SL并靜置5分鐘后，迅速形成了具有不對稱粘附結(jié)構(gòu)的水凝膠。這表明SL有效穩(wěn)定了疏水和親水分子的整合（圖2a、2b）。為了系統(tǒng)研究SL對水凝膠理化性質(zhì)的調(diào)控機制，研究人員設計了不同SL質(zhì)量分數(shù)（0.5、1.0、2.0和3.0 wt%）的水凝膠。明場圖像顯示，與平坦的底面相比，水凝膠的頂面呈現(xiàn)出密集互連的多孔網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，且隨著SL含量增加，孔結(jié)構(gòu)變得更加規(guī)則有序。掃描電鏡（SEM）和三維成像觀察進一步證實，S3.0LAA（3.0 wt% SL）的頂面呈現(xiàn)明顯的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而底面保持光滑平坦（圖2c）。SEM-EDS元素分布圖顯示，SL的特征元素“S”在S3.0LAA頂面的豐度顯著高于底面，表明SL富集在水凝膠的頂面。

X射線光電子能譜（XPS）分析顯示，S3.0LAA底面的COOH、C=O和C-O信號強度顯著增強，而頂面幾乎檢測不到這些基團（圖2d）。表面接觸角（SCA）測試表明，隨著SL含量增加，水凝膠頂面的接觸角從76.1°逐漸增加到100.5°，而底面的接觸角從71.2°降低到48.8°（圖2e），說明更高的SL含量增強了頂面的疏水性和底面的親水性。

為了驗證SL驅(qū)動羧基定向富集的假說，研究人員進行了密度泛函理論（DFT）計算，分析AM、AA和SL之間的靜電相互作用。分子結(jié)合能計算結(jié)果顯示，AM/AA對（-17.20 Kcal/mol）和AM/SL對（-17.74 Kcal/mol）的結(jié)合能低于AA/SL對（-15.68 Kcal/mol），表明在相同環(huán)境條件下，SL與AM的相互作用傾向強于與AA的相互作用。氫鍵相互作用分析顯示，AA/SL中的平均鍵長（2.27 ?）長于AM/SL（2.17 ?）和AM/AA（1.75 ?）（圖2f-2k）。這些結(jié)果表明，隨著SL含量增加，分子間相互作用驅(qū)動AM分子向富SL區(qū)域（頂面）遷移，而AA分子主要向相反方向（底面）遷移，導致羧基在 hydrogel 底面快速積累。

圖2. SLAA Janus水凝膠的表征。 a 木質(zhì)素磺酸鈉（SL）整合疏水組分（LMA）和親水組分（AA、AM）的示意圖。b 水凝膠形成過程的照片。c S0.5LAA和S3.0LAA水凝膠的SEM和3D輪廓圖像（所有實驗均進行三次重復，結(jié)果相似，比例尺：100 μm）。d S0.5LAA和S3.0LAA Janus水凝膠頂面/底面C1s區(qū)域的XPS分峰擬合譜圖。e SLAA Janus水凝膠的SCA測試。f-h 丙烯酰胺、丙烯酸和木質(zhì)素磺酸鈉之間的靜電勢（ESP），以及（i-k）它們靜電相互作用的模擬計算（Eb：結(jié)合能）。

不對稱粘附性能

SLAA Janus水凝膠表現(xiàn)出明顯的雙側(cè)不對稱粘附特性。它可以牢固粘附在各種濕潤組織（脾、腎、肺、心臟和肝臟）以及不同基底材料（金屬、塑料、橡膠、玻璃和木材）上，并能提起超過800克的物體（圖3a）。搭接剪切和180°剝離測試結(jié)果顯示，隨著SL含量增加，剪切應力從201.33 kPa（S0.5LAA）增加到308.33 kPa（S3.0LAA），界面韌性從251.33 J/m2增加到417.46 J/m2（圖3b-3e）。

在一系列離體豬器官實驗中，SLAA Janus水凝膠牢固粘附在受損豬器官表面，封堵后能有效抵抗空氣或水的注射壓力（圖3f、3g）。SEM觀察顯示水凝膠與器官之間形成了均勻粘附的界面（圖3h）。水凝膠粘附在豬心上后在300 kPa高水壓下仍保持原狀（圖3i），粘附在豬皮上后能在水中承載2.5公斤重量（圖3j）。爆破壓力測試表明，SLAA Janus水凝膠的最大爆破壓力約為286.33 mmHg，這一數(shù)值顯著高于常見商業(yè)生物粘合劑的記錄值和典型的最大腹壓（150 mmHg）（圖3k、3l）。

圖3. SLAA Janus水凝膠的不對稱粘附表徵。 a SLAA Janus水凝膠Janus特性展示。b SLAA Janus水凝膠拉伸測試示意圖。c SLAA Janus水凝膠搭接剪切的定量數(shù)據(jù)。d SLAA Janus水凝膠180°剝離測試示意圖。e SLAA Janus水凝膠180°剝離測試的定量數(shù)據(jù)。f、g 通過SLAA Janus水凝膠密封撕裂的豬心、豬食管、豬腸和豬胃的示意圖。h SLAA與豬器官之間粘附界面的SEM圖像（所有實驗均進行三次重復，結(jié)果相似，比例尺：300 μm）。i 水槍沖洗SLAA粘附豬心的粘結(jié)界面的照片。j SLAA Janus水凝膠粘附的豬皮可承受2.5 kg重量的照片。k 爆破壓力裝置示意圖。l SLAA Janus水凝膠與部分商業(yè)生物粘合劑的爆破壓力比較。m SLAA Janus水凝膠與濕組織之間形成的界面排水和可能的非共價相互作用示意圖。

力學性能與溶脹行為

SLAA Janus水凝膠表現(xiàn)出優(yōu)異的力學性能。其驚人的伸長率超過1100%，拉伸后能有效恢復原狀；同時具有高強度耐久性，能承受超過250克的壓力，并能抵抗尖銳物體的損傷（附圖7）。定量測試顯示，隨著SL含量增加，拉伸強度從0.79 MPa（S0.5LAA）降低到0.50 MPa（S3.0LAA），斷裂伸長率從648%增加到1024%（圖4a-4c）；壓縮應力同樣呈下降趨勢，從2.55 MPa降低到1.02 MPa（圖4d-4f）。盡管S3.0LAA的力學性能低于S0.5LAA，但與其他報道的水凝膠生物粘合劑相比仍表現(xiàn)出良好的韌性。連續(xù)的循環(huán)拉伸和壓縮測試表明，SLAA Janus水凝膠在重復機械加載下具有良好的回彈性和恢復能力（圖4g-4j）。

在溶脹行為方面，水凝膠在PBS中浸泡168小時后保持原始尺寸，沒有明顯膨脹。S0.5LAA、S1.0LAA、S2.0LAA和S3.0LAA的平衡溶脹率分別為19.06±0.64%、20.12±0.85%、22.08±0.32%和23.86±0.87%（圖4k、4l）。這些低溶脹率表明水凝膠具有良好的抗溶脹性能，能有效保持其宏觀形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性。雷達圖綜合分析顯示，增加SL含量會適度增加水凝膠的溶脹率和拉伸應變，同時降低底面接觸角、壓縮應力和拉伸應力（圖4m）。與其他已報道的Janus水凝膠相比，SLAA Janus水凝膠在凝膠化時間（5分鐘）和拉伸斷裂應力方面表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢（圖4n）。

圖4. SLAA Janus水凝膠的力學和溶脹表征。 a SLAA Janus水凝膠拉伸測試示意圖。b SLAA Janus水凝膠的拉伸應力-應變曲線和（c）定量數(shù)據(jù)。d SLAA Janus水凝膠壓縮測試示意圖。e SLAA Janus水凝膠的壓縮應力-應變曲線和（f）相應定量數(shù)據(jù)。g 水凝膠的連續(xù)遞增拉伸應力-應變曲線。h SLAA Janus水凝膠的循環(huán)拉伸測試。i SLAA Janus水凝膠的連續(xù)遞增壓縮應力-應變曲線。j 不同應變下SLAA Janus水凝膠的循環(huán)壓縮測試。k S0.5LAA和S3.0LAA水凝膠的溶脹行為圖像。l SLAA Janus水凝膠的溶脹率隨時間變化曲線。m S0.5LAA、S1.0LAA、S2.0LAA和S3.0LAA水凝膠在不同方面的比較。n SLAA與已報道粘附性水凝膠在凝膠時間和拉伸應力方面的綜合比較（NT：未測試）。o 木質(zhì)素磺酸鈉驅(qū)動形成不對稱粘附SLAA Janus水凝膠的示意圖。

體外抗粘附與生物相容性

研究人員使用L929成纖維細胞（與術后粘連相關的細胞系）評估了SLAA Janus水凝膠的體外抗粘附性能。將L929細胞接種在水凝膠的上表面和下表面，培養(yǎng)24小時后，與粘附性底面相比，S0.5LAA和S3.0LAA光滑頂面上的細胞粘附均顯著減少，證明了其體外有效的抗粘附性能（圖5a、5b）。

通過CCK-8 assay和活/死細胞染色評估細胞相容性。當SL的質(zhì)量體積分數(shù)在0%到2.0%范圍內(nèi)時，L929和RAW264.7細胞的存活率與空白對照組相當；當質(zhì)量體積分數(shù)提高到3.0%時，細胞存活率出現(xiàn)輕微下降。共聚焦圖像顯示，用水凝膠浸提液處理的L929細胞表現(xiàn)出與對照組相似的增殖趨勢和形態(tài)特征（圖5c）。水凝膠的溶血率低于5%，符合醫(yī)用材料的國際標準。

體內(nèi)生物相容性通過在小鼠背部皮下植入S3.0LAA水凝膠進行評估。主要器官的組織病理學分析未發(fā)現(xiàn)明顯的炎癥病變或損傷。術后21天內(nèi)傷口完全愈合，未出現(xiàn)感染臨床征象，植入部位被健康的鮮紅色組織覆蓋，未見炎癥浸潤、壞死或化膿（圖5d-5f）。血液分析顯示，健康小鼠與植入水凝膠的小鼠白細胞計數(shù)相當，表明未出現(xiàn)全身性炎癥反應（圖5g）。水凝膠在植入過程中發(fā)生部分降解，降解率約為40%（圖5h）。

圖5. SLAA Janus水凝膠的生物相容性和生物降解表徵。 a 細胞抗粘附實驗示意圖。b L929細胞在水凝膠頂面和底面的代表性F-actin和DAPI染色圖像（所有實驗均進行三次重復，結(jié)果相似，比例尺：50 μm）。c 不同處理下的代表性羅丹明和DAPI染色圖像（所有實驗均進行三次重復，結(jié)果相似，比例尺：50 μm）。d 體內(nèi)皮下植入實驗示意圖。e 植入水凝膠后第0、7、14和21天小鼠的照片（比例尺：5 mm）。f 皮下植入水凝膠的照片。g 對照組和S3.0LAA水凝膠組的血液分析。h 植入的SLAA Janus水凝膠在不同天數(shù)的剩余重量。

體內(nèi)止血性能

研究人員首先在大鼠肝臟出血模型中評估了SLAA的止血效果。與陰性對照組（空白組）和陽性對照組（紗布組、Vetbond?組）相比，S3.0LAA組肝臟出血量顯著減少（圖6a、6b）。S3.0LAA組的失血量約為35 mg，凝血時間約為16秒，均顯著低于空白組（約509 mg，約194秒）、紗布組（約426 mg，約175秒）和Vetbond?組（約171 mg，約75秒）（圖6d、6e）。組織學評估顯示，S3.0LAA組在治療后第3天和第7天的炎癥反應相對較輕，組織纖維化較少（圖6c）。

為進一步評估SLAA Janus水凝膠在大型動物中的止血和密封能力，研究人員在巴馬小型豬上建立了心臟、肝臟、脾臟、肺和胃損傷的體內(nèi)模型。當手術刀片刺穿跳動的心臟時，大量血液迅速流出；立即施用SLAA Janus水凝膠并按壓約10秒后，水凝膠與心臟組織之間形成了牢固且貼合的粘附，有效阻止了失血，這種穩(wěn)定粘附即使在鑷子拉伸和心跳機械應力下仍能保持（圖6g）。同樣，在肺、肝、脾和胃上制作的10 mm寬的切口出血部位，水凝膠迅速建立強效即時粘附，能承受外部機械力（圖6h-6k）。

圖6. SLAA Janus水凝膠的止血能力表徵。 a 大鼠肝臟止血示意圖。b 使用紗布、Vetbond?和SLAA Janus水凝膠進行肝臟止血的照片（比例尺：1 cm）。c 分別使用紗布、Vetbond和SLAA Janus水凝膠愈合3天后肝臟組織的代表性H&E和Masson染色（比例尺：100 μm）。d 不同處理下的失血量和（e）止血時間。f SLAA Janus水凝膠處理豬心臟、肺、肝臟、胃和脾臟損傷模型的示意圖。g-k 使用S3.0LAA水凝膠在豬心臟、肺、肝臟、胃損傷模型中止血的照片（比例尺：2 cm）。

體內(nèi)腸道損傷封閉與組織抗粘連

在大鼠腸道損傷模型中，研究人員評估了SLAA Janus水凝膠預防術后腹腔粘連的效果。在腸道側(cè)壁制作5 mm切口建立模型后，第14天觀察到模型組、縫合組和Vetbond?組的腹壁與傷口之間存在不同程度和嚴重程度的腹腔粘連，而SLAA Janus水凝膠組幾乎未見粘連組織形成，其結(jié)果與假手術組相當（圖7b）。粘連評分顯示，模型組平均評分為4.0（嚴重粘連），縫合組為3.2，Vetbond?組為2.4，而S3.0LAA組僅為0.6（圖7e）。

H&E染色顯示，模型組、縫合組和Vetbond?組在術后14天腸道表面存在大量粘連組織形成和炎癥細胞浸潤；而S3.0LAA組損傷部位的粘連組織顯著減少。Masson染色顯示模型組、縫合組和Vetbond?組存在膠原沉積，表明大量成纖維細胞粘附；而S3.0LAA組的膠原結(jié)構(gòu)與正常組相當（圖7c）。

免疫熒光染色分析顯示，S3.0LAA組TNF-α的表達為40.33±3.68%，分別是損傷組、縫合組和Vetbond?組的0.40、0.45和0.63倍；TGF-β1的表達為34.33±4.78%，分別是損傷組、縫合組和Vetbond?組的0.34、0.38和0.50倍（圖7d、7f、7g）。這些結(jié)果表明SLAA Janus水凝膠有效減輕了傷口炎癥和纖維化，防止了術后粘連的發(fā)生。實驗結(jié)束后，S3.0LAA的SEM圖像顯示頂面仍保持多孔疏水結(jié)構(gòu)，底面保持親水，接觸角分別為100.3°和55.7°，表明Janus水凝膠的疏水層在應用過程中未被破壞。

圖7. 體內(nèi)腸道損傷修復。 a 大鼠腸道損傷模型示意圖。b 不同處理下腹腔粘連的照片（比例尺：2 cm）。c 治療后14天腸道和腹壁的代表性H&E和Masson染色（比例尺：100 μm）。d 術后14天TGF-β1和TNF-α的免疫熒光染色照片及（f、g）相應定量分析（比例尺：100 μm）。e 治療后14天的粘連評分。

體內(nèi)子宮內(nèi)膜損傷修復

研究人員建立了大鼠子宮內(nèi)膜損傷模型，模擬剖宮產(chǎn)、刮宮術或子宮肌瘤切除術對子宮的損傷（圖8a）。與假手術組相比，模型組、縫合組和Vetbond?組在治療期間雙側(cè)子宮損傷部位表現(xiàn)出不同程度的粘連；而S3.0LAA組粘連顯著減少，表明水凝膠有效保護了受損的子宮組織（圖8b）。H&E染色顯示，模型組、縫合組和Vetbond?組的子宮傷口未能完全閉合或因組織粘連出現(xiàn)表面凹陷；S3.0LAA水凝膠治療后，子宮形態(tài)正常，與假手術組相當（圖8c）。定量分析顯示，S3.0LAA組的子宮內(nèi)膜厚度為653.16±41.78 μm，分別是模型組、縫合組和Vetbond?組的1.89、1.65和1.24倍，與假手術組（717.26±54.03 μm）相近（圖8d）。Masson染色顯示S3.0LAA組纖維化面積較模型組顯著減少（圖8e）。

增殖標志物PCNA的免疫組化染色顯示，S3.0LAA水凝膠組的PCNA表達水平（71.33±5.31%）低于模型組、縫合組和Vetbond?組，表明傷口愈合進程更早，水凝膠在促進組織修復中發(fā)揮了積極作用（圖8f）。免疫熒光染色分析顯示，S3.0LAA組TNF-α的表達為35.67±4.50%，分別是模型組、縫合組和Vetbond?組的64%、59%和46%；TGF-β1的表達為37.67±6.02%，分別是模型組、縫合組和Vetbond?組的62%、51%和44%（圖8g-8i）。α-SMA和CD31表達的增加反映了再生子宮內(nèi)膜組織周圍血管密度更高。這些發(fā)現(xiàn)共同證明，SLAA Janus水凝膠通過抑制組織粘連有效減少子宮內(nèi)膜纖維化和炎癥，促進子宮內(nèi)膜細胞增殖和血管生成，從而加速子宮內(nèi)膜損傷的修復。

圖8. 體內(nèi)子宮內(nèi)膜損傷修復。 a 大鼠子宮內(nèi)膜損傷模型示意圖。b 不同處理下第0、7和14天大鼠子宮的照片（比例尺：500 μm）。c 治療后14天子宮的代表性H&E、Masson和免疫組化PCNA染色圖像（比例尺：500 μm）。（d）子宮內(nèi)膜厚度、（e）膠原密度和（f）治療后組織PCNA相對表達水平的定量分析。g 治療后14天子宮的代表性TNF-α、TGF-β1、CD31和α-SMA免疫熒光染色圖像（比例尺：100或50 μm）。（h）TNF-α和（i）TGF-β相對表達水平的定量分析。

總結(jié)與展望

本研究創(chuàng)新性地利用木質(zhì)素磺酸鈉誘導羧基異質(zhì)聚集，構(gòu)建了一種高性能Janus水凝膠。該水凝膠的凝膠化過程簡單快速，僅需5分鐘即可完成，相比大多數(shù)已報道的Janus水凝膠（涉及仿生結(jié)構(gòu)設計、單側(cè)離子封端和多層復合等復雜多步制備工藝）具有顯著優(yōu)勢。作為一種成本低廉、環(huán)保、高分散性和穩(wěn)定性的陰離子表面活性劑，SL被創(chuàng)新性地用于Janus水凝膠的制備，作為誘導羧基異質(zhì)聚集的關鍵組分，為具有臨床轉(zhuǎn)化和規(guī)模化生產(chǎn)潛力的Janus水凝膠設計開辟了新途徑。

作為一種即用型生物貼片，SLAA Janus水凝膠在SD大鼠和巴馬豬的心、肝、脾、肺和胃損傷中實現(xiàn)了即時密封和止血。在大鼠腸道和子宮內(nèi)膜損傷模型中，它克服了縫合線的關鍵局限性——操作復雜、二次出血和醫(yī)源性損傷——同時加速傷口愈合并顯著減少術后粘連。鑒于其簡便的一步制備工藝、高機械強度和顯著的不對稱濕組織粘附性能，SLAA Janus水凝膠為下一代生物粘合劑提供了可行且實用的設計思路，展示了其作為內(nèi)傷口修復縫合線替代品的巨大潛力。