雙網絡水凝膠，發了一篇Angew！

超分子水凝膠憑借其可逆的非共價相互作用，在生物醫學領域展現出巨大潛力，尤其是在組織工程和藥物遞送方面。然而，這類材料雖然具有刺激響應性和自愈合等動態特性，卻常常面臨力學性能較弱的挑戰。為了擴展其應用范圍，研究人員嘗試引入第二層共價聚合物網絡，構建雜化雙網絡水凝膠，從而顯著提升材料的抗拉伸、抗壓縮和抗斷裂能力。然而，盡管這種策略在力學增強方面取得了進展，共價聚合物的加入如何影響超分子網絡的精細納米結構，長期以來仍是一個被忽視但至關重要的科學問題。特別是在高分子濃度升高時，擁擠效應和耗盡力可能誘導超分子纖維發生高階組裝，這一現象在凝膠相中尚未得到系統探索。

針對上述挑戰，萊頓大學Roxanne E. Kieltyka教授課題組首次揭示了共價網絡形成速率對雜化雙網絡水凝膠中超分子纖維結構的決定性作用。通過利用逆電子需求狄爾斯-阿爾德（IEDDA）反應的可調動力學特性，研究團隊發現：緩慢的共價交聯過程能夠促使超分子纖維在耗盡作用下自組裝成微米級纖維束，而快速的共價網絡形成則會動力學鎖定低納米尺度的單根纖維結構。這種微觀結構的差異最終導致緩慢形成的雙網絡水凝膠在壓縮韌性上實現了近兩倍的提升，為通過反應動力學調控軟物質多尺度結構提供了全新思路。相關論文以“Covalent Network Formation Rate Controls Depletion-Induced Supramolecular Assembly in Hybrid Double Network Hydrogels”為題，發表在Angewandte Chemie International Edition上。

雙網絡水凝膠的設計理念

為直觀展示這一創新策略，研究團隊在示意圖中呈現了超分子-共價雙網絡（SCDN）水凝膠的構建原理。圖中展示了兩種不同取代基的四嗪功能化PEG大單體（PEG-Tz1和PEG-Tz2），它們與PEG-降冰片烯（PEG-Nb）通過IEDDA點擊反應形成共價網絡。與此同時，基于方酰胺的三足兩親分子（SQ）自組裝成超分子纖維網絡。關鍵在于，共價網絡的形成速率——無論是快速還是緩慢——決定了超分子纖維是保持分散狀態還是組裝成致密的纖維束，進而影響水凝膠在壓縮載荷下的力學響應行為。

圖1： 本工作中制備的超分子-共價雙網絡水凝膠示意圖。(A) 末端功能化四嗪（C-6位帶有不同取代基）的PEG大分子單體（PEG-Tz1和PEG-Tz2）通過逆電子需求Diels-Alder點擊反應與PEG-降冰片烯（PEG-Nb）反應控制共價網絡的形成速率。這些共價網絡在基于方酰胺的三腳架兩親分子（SQ）存在下形成，后者自組裝成超分子纖維，它們共同構成SCDN水凝膠。(B) SCDNs（藍色網絡）由不同速率形成的共價網絡與超分子纖維（棕色網絡）組成的概念性圖示，以及耗竭誘導超分子組裝對雜化雙網絡水凝膠壓縮行為的影響。深紅色纖維代表由棕色單根超分子納米結構形成的超分子纖維束。

流變學揭示的雙階段凝膠化過程

通過振蕩流變學測量，研究人員量化了不同四嗪取代基對網絡形成速率的影響。實驗結果顯示，帶有甲基取代基的PEG-Tz1與PEG-Nb反應較慢，在37°C下凝膠點約為30分鐘（4 mM濃度），而氫取代的PEG-Tz2則反應迅速，凝膠點僅需約2分鐘。當將超分子SQ纖維引入體系后，慢速體系表現出明顯的雙階段凝膠化曲線：初期儲能模量（G'）約100 Pa，對應SQ網絡的初步形成；隨后在3小時內逐漸上升至1-2 kPa，反映共價網絡的逐步建立。相比之下，快速體系僅呈現單階段凝膠化曲線，在60分鐘內G'即達到4-5 kPa的平臺值。值得注意的是，盡管兩種體系的最終模量相近，但慢速體系在SQ濃度高于3 mM時出現了G'的輕微下降，暗示著結構的特殊演化。

圖2： 使用不同電子特性四嗪的SCDN水凝膠的振蕩流變學測量。含遞增濃度SQ的水凝膠儲能模量隨時間變化，使用快速PEG-Tz2（A、B）或慢速PEG-Tz1（C、D）大分子單體制備。快速PEG-Tz2（B）和慢速PEG-Tz1（D）SCDNs中各種SQ濃度下的平臺儲能模量（實心條）和損耗模量（條紋條）值。時間掃描測量使用0.05%應變、1 Hz頻率和37°C條件。平均值±標準差，n=3。

壓縮力學性能的顯著差異

單軸壓縮測試進一步揭示了兩種網絡在力學性能上的巨大差異。慢速PEG-Tz1/Nb雙網絡水凝膠的應力-應變曲線顯示，其斷裂應力、斷裂應變和韌性均顯著優于快速PEG-Tz2/Nb體系。定量分析表明，慢速體系的韌性從快速體系的約7 kJ/m3提升至約15 kJ/m3，實現了超過兩倍的增強。同時，斷裂應力和斷裂應變也相應提高。這一顯著的壓縮性能改善表明，慢速共價網絡形成過程中，超分子纖維的束狀結構能夠更有效地傳遞載荷并耗散能量，從而賦予材料更高的抗壓能力。

圖3： 共價單網絡和SCDN水凝膠的壓縮流變學結果。(A) 單軸應力-應變曲線，(B) 韌性，(C) 斷裂應力，(D) 斷裂應變。濃度：SN：3 mM PEG-Tz1/Nb（慢速）或PEG-Tz2/Nb（快速），SCDN：4 mM SQ和3 mM PEG-Tz1/Nb（慢速）或PEG-Tz2/Nb（快速）。樣品以10 μm/s的速度壓縮。平均值±標準差，n=2。

冷凍電鏡揭示的微觀形貌差異

利用冷凍掃描電子顯微鏡（cryo-SEM），研究團隊觀察了單一共價網絡和雙網絡水凝膠的微觀形貌。結果顯示，快速交聯的PEG-Tz2/Nb單一網絡呈現出較大的孔徑，而慢速交聯的PEG-Tz1/Nb網絡則具有更小且更均勻的孔結構。當引入SQ超分子纖維后，這種微觀結構差異基本得以保持。然而，由于共價網絡與超分子纖維在形貌上難以區分，cryo-SEM無法直接可視化纖維束的形成，這促使研究人員轉向更高分辨率的共聚焦顯微鏡技術。

圖4： 單網絡（左）和SCDN（右）水凝膠的冷凍掃描電鏡成像（A-D）。快速PEG-Tz2/Nb（A、B）和慢速PEG-Tz1/Nb（C、D）的顯微照片。(E) 基于冷凍掃描電鏡圖像計算的孔徑參數。濃度：SN：3 mM PEG-Tz1/Nb或PEG-Tz2/Nb，SCDN：4 mM SQ和3 mM PEG-Tz1/Nb或PEG-Tz2/Nb。標尺：300 nm。

共聚焦顯微鏡實時追蹤纖維束動態形成

為了實現超分子纖維的可視化，研究人員合成了熒光標記的SQ-Cy5單體（1 mol%），并將其與未標記的SQ共組裝。通過共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）對雙網絡水凝膠進行長達3小時的實時成像，一個令人驚嘆的動態過程得以揭示。在慢速交聯的PEG-Tz1/Nb網絡中，SQ纖維在3小時內逐漸增粗、伸長，最終形成直徑達296 ± 40 nm、長度達數微米的致密纖維束。這一時間尺度與流變學中G'達到平臺值的時間完美吻合。相反，在快速交聯的PEG-Tz2/Nb網絡中，SQ纖維始終保持均勻分散狀態，即使監測長達一周也未觀察到任何成束現象。這一鮮明對比表明，快速共價交聯在超分子纖維發生側向相互作用之前就將其動力學鎖定，而慢速交聯則為耗盡力驅動的纖維組裝提供了充足的時間窗口。

圖5： (A) 快速和慢速SCDN水凝膠制備流程示意圖。(B) 快速（頂部）和慢速（底部）SCDN水凝膠（4 mM SQ和3 mM PEG-Tz1/Nb或PEG-Tz2/Nb）從t=0到3小時（每小時間隔）的代表性共聚焦成像時間序列。圖像中調整了亮度和對比度。原始（未處理）顯微照片見圖S6。SQ水凝膠含有1 mol% SQ-Cy5。標尺：10 μm。

大分子擁擠劑誘導的纖維束形成

為了解耦共價交聯反應與擁擠效應的貢獻，研究人員分別將SQ纖維與PEG-Tz1、PEG-Tz2、PEG-Nb以及未修飾的PEG-OH和葡聚糖混合。令人驚訝的是，僅添加3 mM的PEG-Nb或PEG-OH即可誘導SQ纖維形成直徑約300 nm的束狀結構，而PEG-Tz1和PEG-Tz2則無法實現這一效果。動態光散射（DLS）分析揭示，四嗪功能化的PEG大單體在水溶液中傾向于自發聚集，導致其有效擁擠能力降低；而PEG-Nb和PEG-OH則保持較好的膠體穩定性，能夠產生更強的耗盡力。此外，經典的擁擠劑葡聚糖（70 kDa，0.4 mM）同樣能夠誘導形成直徑更大的纖維束（448 ± 62 nm）。這些結果明確指出，純排阻體積效應足以驅動SQ超分子纖維的側向組裝，而臨界濃度約為3 mM。

圖6： (A) 使用各種大分子擁擠劑的超分子SQ水凝膠（4 mM）制備流程示意圖。(B) 含PEG-Nb（1-5 mM）的SQ水凝膠的共聚焦圖像，混合后立即成像（t=0 h）。(C) 含不同大分子擁擠劑（3 mM PEGs和0.4 mM葡聚糖）的SQ水凝膠的共聚焦圖像，37°C孵育3小時后成像。SQ水凝膠含有1 mol% SQ-Cy5。標尺：10 μm。

光譜學證實分子堆積模式保持不變

紫外-可見光譜（UV-Vis）分析表明，無論是在PEG-Nb、PEG-OH還是葡聚糖存在下，SQ溶液的吸收光譜均與純SQ溶液完全一致，特征峰位于318 nm（頭尾氫鍵組裝體）和266 nm（肩峰）。然而，所有擁擠劑存在下的吸光度均約為純SQ溶液的一半，這與更大尺寸組裝體的形成相符。傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）進一步證實，在凍干的SQ-PEG-Nb混合物中，SQ的N-H伸縮振動、方酰胺環呼吸振動以及氨基甲酸酯的C=O伸縮振動均未發生改變，表明纖維束中SQ單體的分子堆積模式與單根纖維完全相同。這一發現至關重要，它證明耗盡誘導的組裝僅發生在介觀尺度，而不改變納米尺度的分子堆積，從而保留了超分子材料的功能性。

圖7： (A) 0.4 mM SQ（黑色虛線）和0.4 mM SQ與不同大分子單體的紫外-可見光譜：3 mM PEG-Nb（最深藍色）、3 mM PEG-OH（藍色）和0.4 mM葡聚糖（最淺藍色）。(B) 凍干的4 mM SQ和PEG-Nb混合物（3 mM，藍色；5 mM，黑色）樣品的傅里葉變換紅外光譜，突出氫鍵區域。(C) 0.4 mM SQ和3 mM PEG-Nb混合物的共聚焦圖像，顯示纖維束的形成。標尺：10 μm。

總結與展望

本研究系統地揭示了共價網絡形成動力學在調控雜化雙網絡水凝膠中超分子纖維分級組裝中的決定性作用。通過調節IEDDA反應的速率，研究團隊首次建立了大單體反應活性與分子擁擠效應之間的關聯，實現了對超分子纖維束形成的精確控制。慢速網絡形成為超分子纖維提供了足夠的動態遷移時間，使其在耗盡作用下組裝成束；而快速交聯則動力學鎖定系統于低納米尺度的初始組裝狀態。這種動力學差異最終轉化為模塊化的應力松弛和壓縮性能：快速體系表現出更快的應力松弛但較低的韌性，而慢速體系則實現了韌性的兩倍增強。展望未來，這一設計原理可擴展至其他共價鍵反應體系（如pH、溫度、光響應體系）和多種超分子單體，為構建介觀尺度可編程的軟物質材料提供了全新維度，在組織工程、軟體機器人和智能材料等領域具有廣闊的應用前景。