Cell Stem Cell?|?非病毒LNP遞送系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)原位修復(fù)與功能恢復(fù)

撰文|亦

先天性魚(yú)鱗病（Autosomal recessive congenital ichthyosis ，ARCI）目前缺乏有效治療手段，現(xiàn)有療法主要依賴(lài)耗時(shí)的癥狀管理（如每日長(zhǎng)時(shí)間護(hù)理、系統(tǒng)性維A酸使用）【1，2】，無(wú)法根治疾病。近年來(lái)，基于基因增強(qiáng)和蛋白質(zhì)替代的策略雖有一定進(jìn)展，但多采用病毒或非病毒載體進(jìn)行遞送【3，4】，存在免疫原性高、包裝能力有限、易引發(fā)插入突變或基因表達(dá)失調(diào)等問(wèn)題。CRISPR基因編輯技術(shù)的發(fā)展為精準(zhǔn)糾正致病突變提供了新可能，但目前在皮膚疾病領(lǐng)域的應(yīng)用仍多局限于細(xì)胞模型或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)【5，6】，缺乏針對(duì)人類(lèi)皮膚復(fù)雜結(jié)構(gòu)與屏障功能的原位編輯策略，且病毒載體的長(zhǎng)期表達(dá)特性不利于基因編輯的安全性控制。因此，亟需開(kāi)發(fā)一種安全、高效、可局部遞送的非病毒基因編輯系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)人皮膚疾病的原位糾正。

2026年1月27 日，柏林健康研究所Sarah Hedtrich團(tuán)隊(duì)在Cell Stem Cell上發(fā)表題為LNP-based non-viral in situ gene editing of the congenital ichthyosis-causing mutations in human skin models的文章。提出 一種基于激光輔助的脂質(zhì)納米顆粒（LNP）遞送系統(tǒng)，用于在人類(lèi)皮膚模型中原位糾正導(dǎo)致ARCI的TGM1 c.877-2A>G剪接位點(diǎn)突變，并在體內(nèi)外都證實(shí)了該LNP系統(tǒng)的良好安全性、低免疫原性及無(wú)系統(tǒng)性分布特性 。

精確糾正TGM1剪接位點(diǎn)突變c.877-2A>G 的 挑戰(zhàn)在于目標(biāo)堿基旁存在一個(gè)關(guān)鍵的“旁觀者”核苷酸，若被編輯會(huì)產(chǎn)生非功能序列。為此，研究比較了標(biāo)準(zhǔn)編輯器BE4max與兩種新一代窄窗口編輯器eTD-CBE和eA3G-CBE，并優(yōu)化了總RNA劑量及mRNA/sgRNA比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， eTD-CBE在目標(biāo)位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了最高約26%的編輯效率，且完全避免了旁觀者編輯 。 而總RNA劑量在3-10 μg時(shí)編輯效率達(dá)到平臺(tái)期，更高的sgRNA比例雖略微提升編輯但伴隨細(xì)胞毒性 。這為后續(xù)實(shí)驗(yàn)選定了eTD-CBE作為最佳編輯器并確定了安全的RNA劑量范圍。

為了在模擬人類(lèi)皮膚組織復(fù)雜結(jié)構(gòu)的模型中評(píng)估基因編輯療效，研究利用攜帶TGM1突變的患者細(xì)胞構(gòu)建了3D ARCI皮膚疾病模型。通過(guò)免疫熒光、屏障滲透實(shí)驗(yàn)、原位酶活染色及蛋白質(zhì)組學(xué)分析，系統(tǒng)比較了正常與ARCI模型的表型差異。結(jié)果證實(shí)，ARCI模型表皮分化受損（filaggrin、involucrin等標(biāo)志物表達(dá)降低）、組織結(jié)構(gòu)紊亂、皮膚屏障功能缺陷，并且完全喪失了TG1酶活性，蛋白質(zhì)組學(xué)也顯示TGM1、KRT10等屏障相關(guān)蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，成功模擬了疾病的關(guān)鍵病理特征。

為了克服皮膚角質(zhì)層對(duì)生物大分子的遞送屏障，研究將臨床已批準(zhǔn)的激光微消融技術(shù)與反射共聚焦顯微鏡結(jié)合，在皮膚上制造精確深度的微孔以遞送LNP。通過(guò)劑量反應(yīng)曲線確定在人類(lèi)皮膚和ARCI模型中， 7 μg總RNA可實(shí)現(xiàn)最優(yōu)的原位編輯效率 （約7.36%和平均12%的基因糾正）。重要的是， 在該劑量下未檢測(cè)到旁觀者編輯，且脫靶編輯分析（包括NGS、CAST-seq和R-loop assay）顯示編輯特異性極高，僅在一個(gè)非編碼區(qū)檢測(cè)到<1%的極低水平離靶事件 。功能上， 3 μg總RNA處理即可最高效地恢復(fù)TG1酶活性 ，蛋白質(zhì)組學(xué)分析也證實(shí)了全長(zhǎng)TGM1蛋白的表達(dá)及相關(guān)皮膚分化標(biāo)志物的有益變化。

鑒于皮膚是高免疫原性器官，還需要評(píng)估LNP制劑在皮膚相關(guān)免疫細(xì)胞和新鮮人皮膚組織中的免疫激活潛力。研究用不同載藥（如未修飾mRNA、修飾mRNA、RNP）和不同脂質(zhì)組成的LNP刺激人單核細(xì)胞源性樹(shù)突狀細(xì)胞（MoDCs），并以COVID-19 mRNA疫苗和病毒載體疫苗為參照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 載有RNP或未修飾mRNA的DOPE-LNP能顯著上調(diào)MoDCs的MHC II類(lèi)及CD40/CD86共刺激分子表達(dá)，而本研究的主導(dǎo)LNP H制劑即使載有未修飾mRNA也未引發(fā)顯著免疫反應(yīng)。將LNP局部應(yīng)用于新鮮人皮膚后，也未觀察到遷移免疫細(xì)胞激活或促炎細(xì)胞因子釋放，表明LNP H具有優(yōu)異的免疫相容 。

為全面評(píng)估原位基因編輯療法的安全性，尤其是局部給藥后LNP及其載體的全身生物利用度，研究在小鼠體內(nèi)進(jìn)行了毒性實(shí)驗(yàn)。通過(guò)調(diào)整激光參數(shù)和設(shè)計(jì)針對(duì)小鼠Tgm1同源序列的sgRNA，評(píng)估了單次和重復(fù)給藥（最高30 μg RNA/只）后的局部耐受性、全身毒性及器官分布。結(jié)果顯示，治療未引起小鼠死亡、體重變化或局部皮膚刺激，組織學(xué)檢查也未發(fā)現(xiàn)中度或強(qiáng)烈的局部免疫反應(yīng)或白細(xì)胞浸潤(rùn)。活體成像和DESI-MSI代謝成像分析證實(shí)，熒光信號(hào)和LNP特異性脂質(zhì)離子僅存在于處理部位的皮膚中，在心、肝、脾、肺等其他器官均未檢測(cè)到顯著積累，表明 LNP及其遺傳貨物無(wú)全身性分布，具有良好的局部安全性 。

總的來(lái)說(shuō)， 本研究成功開(kāi)發(fā)了一種基于激光輔助、非病毒LNP遞送的原位基因編輯策略，在高度模擬人體皮膚結(jié)構(gòu)的三維ARCI疾病模型中，實(shí)現(xiàn)了對(duì)最常見(jiàn)致病突變TGM1 c.877-2A>G的高效、精準(zhǔn)糾正，并恢復(fù)了約30%的TG1功能酶活。安全性評(píng)估表明，該LNP系統(tǒng)具有極低的免疫原性、優(yōu)異的局部耐受性，且無(wú)全身性分布風(fēng)險(xiǎn)。 這項(xiàng)研究首次在人類(lèi)皮膚疾病模型中完成了從突變糾正到功能恢復(fù)的全鏈條驗(yàn)證，不僅為目前缺乏根治手段的先天性魚(yú)鱗病提供了首個(gè)潛在治愈性療法方案，更建立了一個(gè)安全、微創(chuàng)、可局部應(yīng)用的基因編輯技術(shù)平臺(tái)，為治療其他遺傳性皮膚病乃至需要局部精準(zhǔn)遞送的基因治療領(lǐng)域，開(kāi)辟了全新的轉(zhuǎn)化路徑。

https://doi.org/10.1016/j.stem.2026.01.001

制版人： 十一

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