這種技術的出現，讓我們看見了生物體內前所未見的微觀世界 | 科學講壇——鞏巖

做了30年的科研工作，

我的體會就是如果你認準一個目標，

就一定要堅持做下去。

鞏 巖· 中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所研究員

格致論道第45期 | 2019年9月22日 北京

這是一個關于突破光學衍射極限，打造觀測微觀世界慧眼的故事。

2018年世界衛生組織公布了世界癌癥患者的數量，共有1810萬癌癥患者，其中960萬人死于癌癥。我國是人口大國，每年都有很多新增癌癥患者。在我國，平均每分鐘就有7人被確診為癌癥患者，每5分鐘就有5人死于癌癥。

實際上，在我們平時說話的同時，可能已經有5個家庭永遠失去了他們的親人。這個數字非常驚人，也非常令人痛心。為什么會有這樣的情況？問題到底出在哪兒？癌癥的機理是什么？我們怎么去準確地診療癌癥？怎么用藥物才能有效地治療癌癥呢？

▲ 宮頸癌海拉細胞

這是一張宮頸癌海拉細胞的圖片。海拉細胞實際上是研究細胞的一個“小白鼠”。這個細胞的尺度約為10微米。我們研究癌癥，不僅僅要看這個細胞的輪廓，還要看到它里面的這些紅絲，這些小綠點，這些代表的是細胞中蛋白質等微細的結構。

這些結構的尺度一般在10納米左右，用常規的顯微鏡肯定無法看到。還有一件讓全世界都很惱火的事，就是全球人口正在逐漸老齡化。隨著人口老齡化的發生，老年疾病（學術名詞叫神經退行性疾病）的患病人數也在大量增加。

▲ 阿爾茲海默癥患者大腦

這是一個阿爾茨海默病（俗稱老年癡呆癥）患者的大腦圖，這個大腦和正常人的大腦相比，已經嚴重萎縮了。現在全世界都不知道阿爾茨海默病是如何發生的，衰老為何導致阿爾茨海默病患者發生如此大的變化。

要研究這個機理，我們要看清神經元細胞，要了解它是怎樣的結構，尤其更微細的結構，以及神經元細胞如何傳導信號這樣的一個過程。傳統顯微鏡顯然無法幫我們實現這些，所以我們就需要發明一種更高分辨率的顯微鏡，這就是“超高分辨熒光顯微鏡”。

探索微觀世界的“慧眼”

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有了這個超高分辨的熒光顯微鏡，我們就可以看清我們從來沒有見到的微觀世界。

我們每個人都去過醫院，都做過CT、核磁共振這樣的檢查。這類檢查的尺度只在器官或者組織水平。它的大小通常為幾微米或者幾毫米，像我們的血管、肺或者骨骼。

因為我們的生物學家要看清病毒，要看清蛋白質這樣尺度的微細結構。辦法是有的，那就是用電子顯微鏡。電子顯微鏡和原子顯微鏡可以實現以上要求。

但電子顯微鏡和原子顯微鏡都有一個最大的缺點——不能進行活體細胞的觀測。傳統的光學顯微鏡顯微鏡可以克服這個缺點。

我們很小的時候就知道光學顯微鏡，然而實際上，用傳統光學顯微鏡，我們只能看到200納米，也就是能分辨0.2微米這樣尺度的物體。

▲ 左：想要看到的，右實際看到的

光學顯微系統的成像原理：一個理想的物點經過光學顯微系統之后，它會形成一個彌散的斑。就好像這只小貓，如果把它比喻成一個理想的物點，那么經過顯微系統后，它就變得模糊了。

一個點是模糊的，兩個點經過顯微系統之后依然是模糊的。像這幅圖，如果兩個點離得足夠遠，我們人眼能把它們分清。

如果兩個點離得足夠近，我們依然能把它們分清。那么這個時候，我們就認為它達到了一個極限的水平，就像這幅圖。如果兩個點離得特別近，近到我們很難把它們分清楚，那么這時的極限距離是多少？

▲ 德國科學家阿貝 （1840～1905）：“魔咒”公式

1873年，德國一位叫恩思特·阿貝的偉大科學家通過嚴格的理論推導，給出了這個極限距離，用公式表達就是d=λ/2nSinα。

人們為了紀念這位偉大的科學家，把這個公式刻到了他的墓碑上。

通過這個公式可以看出，如果我們在可見光波段，就是λ等于400納米的時候，n和Sinα都等于1的時候，這個光學顯微鏡的極限分辨率實際上只有λ/2，也就是只有200納米。

破解光學顯微系統的分辨率魔咒

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這個公式的發明確實解開了困擾科學家們多年的一個難題。“光學顯微系統能達到多少分辨率”這一難題就像魔咒一樣束縛了科學家的思維。人們一直想找到辦法破解這個魔咒，使顯微系統能夠看清更細微的物體。

▲ 威廉姆?莫爾納（William Moerner）：美國化學家

埃里克?白茲格（Eric Betzig）：美國應用物理學家

斯蒂芬?黑爾（ Stefan Hell ）：德國物理學家

后來有三位科學家非常幸運的破解了這一魔咒。他們就是發明了熒光顯微技術的三位科學家。為了紀念這三位科學家在超分辨顯微系統方面所做出的貢獻，2014年諾貝爾化學獎就頒給了他們，他們中有兩位是美國人，一位是德國人。

為什么頒的是化學獎，而不是物理學獎？難道光學顯微鏡是化學問題嗎？

人們都有這樣一種感覺，就是我們在一個黑暗的樹林里可以看到一群螢火蟲在飛舞，但如果想看一只螢火蟲飛舞就很難了。

▲ 熒光蛋白開關的方法

但是美國化學家莫納做到了。在生物界，他做到讓人們只看見一個熒光分子在閃亮。這是他很重要的一個貢獻，因為他發明了熒光分子的開關技術。

當一束高能的光照射到熒光分子的時候，熒光分子就亮了；再用別的照射它，又可以讓它熄滅，就像自己家的燈的開關一樣。

這項化學技術實際上是實現光學超分辨的核心之一，所以給他頒的是諾貝爾化學獎。

▲ PLAM工作原理

受到莫納的啟發，美國的另一位科學家——白茲格，把單分子開關的技術應用到了顯微系統上，發明了光激活定位顯微技術，簡稱PALM技術。

比如左邊這幅圖，每次每個圖都在閃爍，每次只看一個點，同時把它的位置記錄下來。通過很多幅這樣圖像的疊加之后，我就可以看到最右邊具備超分辨水平的圖了。

這就好比看銀河系的時候看不清，但如果每次只讓一顆星閃亮，等所有星星都分別成像以后，再把它們疊加起來，就可以看清整個銀河系了。

實際上白茲格是一個中國女婿。他是一個富二代，但他不想接手家族的企業，而是想追尋自己熱愛的顯微系統的研究。

▲ Eric Betzig在家搭建的超分辨顯微鏡

這張照片就是他在自己家客廳組裝的PALM顯微鏡。他的生活正應了現在一句很流行的話：如果你不好好做科研，那么只好回家繼承百萬家產。

獲得這次諾貝爾化學獎的還有德國科學家黑爾。他發明的技術實際上是受激發射損耗顯微技術，簡稱STED。他和白茲格完全是兩類人。他是一個屌絲，為了喜愛的顯微鏡事業，他需要經常到外面找科研經費。

▲ 受激發射損耗顯微技術 STED

他也發明了一種獨特的辦法，就是用一束光去照明所有熒光分子的時候，這些熒光分子都會被點亮。這時候，用另一束像“甜甜面包圈”一樣的光，去熄滅這些熒光分子周圍的光，那么就會只剩下中間一點納米量級的分子的光，如此，我們就實現了超分辨。

受這兩位大師的啟發，現在的科學家也發明了很多其他的顯微系統。像干涉定位顯微系統，像結構光照明顯微系統。這些系統都為科學界，為生物細胞研究，做出了巨大的貢獻。

獲得諾貝爾獎的科學家都非常聰明，而比他們更聰明的是一些商人。

▲ 顯微鏡壟斷：四大百年老店

他們的技術獲獎了之后，世界四大顯微鏡生產企業——德國的蔡司、萊卡，日本的尼康、奧林巴斯，就把他們的技術買斷，然后將其變成了商品化的儀器。

現在全世界顯微鏡市場基本被這四家公司壟斷了。這四家公司都是百年公司，他們具有悠久的歷史。

中國顯微鏡現狀

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而我們中國的顯微鏡現狀又是怎么樣的呢？

中國的顯微鏡歷史并不短，有70年。中國第一家顯微鏡工廠是1943年在重慶成立的，后來搬到了江蘇南京，叫江南光儀廠。

這張圖是江南光儀廠當時建廠時的照片。

這張是他們的廠房。

我國第一臺顯微鏡誕生于1953年，我們利用東德蔡司（“二戰”時，蔡司公司分成了西德和東德兩家）的圖紙造出來了我國第一臺顯微鏡。但是，現在我國只能生產中、低端的顯微系統，高端顯微系統及其核心部件完全依靠進口。

中國高端顯微系統雖然發展歷史不長，但我們絕不缺乏有世界眼光的科學家。2012年，中國科學院蘇州醫工所的所長唐玉國就率領團隊開展了超分辨核心部件和系統的研究工作。

我是2014年有幸加入到這個團隊的，我在這個團隊里主要負責顯微物鏡的研發。顯微物鏡是顯微系統的一個核心部件，也可以說是最重要的部件。為什么呢？因為顯微物鏡的數值孔徑，就是剛才阿貝公式下面那個nSinα，決定了整個顯微系統的物理分辨率。

這是我們研發的一個具有世界水平的物鏡。它的視場可以達到6毫米，分辨率可以到0.5微米，可用于我們腦神經細胞、神經區域的拍攝。因為海馬區很大，我們要看清楚的話，必須用這種大視場的物鏡系統去研究。

這個物鏡可以用于基因測序。

這張圖實際上是我國第一支NA1.45高數值孔徑顯微鏡。它就是我們超分辨系統用的最多的一個物鏡。這個物鏡雖然只有40毫米長，但內部結構非常復雜。

▲ 光機設計 光機加工 裝配集成 像質檢驗 物鏡封裝

這張圖就是它的一個剖視圖。在40毫米長的范圍內，有大約十幾片到二十幾片的小光學元件，其中有的小光學元件只有米粒般大小。

這個系統研制起來也非常艱難。除了光學材料、加工、鍍膜，最難的地方就是把所有的光學件和機械件集成起來。

因為我國目前還缺乏物鏡集成這方面的人才，我們的團隊更缺乏有經驗的科研人員。后來，我們在全國所有的光學公司尋找這樣的人，終于在南京找到了一位老工人師傅，他有18年的物鏡裝配經驗。我們把他請到實驗室，經過一年的反復摸索，終于裝出了中國第一支NA1.45的顯微物鏡。

但是高興沒有多久，我們又犯了難。因為老師傅裝配物鏡只能靠他的經驗，靠他的手感，我們不能復制，也不能保證所有物鏡的質量和效率都很好。為此，我們科研人員不得不一頭扎進了實驗室，研發物鏡裝配的一體化系統。

現在我們已經在這方面完全取得了突破，我們有自己標準化的、數字化的裝配流程和工藝。在物鏡研發過程當中，團隊成員經常加班，經常點外賣。

有時候外賣點的太多，外賣小哥送不過來，飯店老板就直接送過來了。所以我們研發物鏡不僅把中國的科研事業提到了一定的程度，打破了國外的壟斷，還帶動了餐飲行業的發展。

▲ 雙光子-STED顯微鏡

令我印象最深刻的是研發這種雙光子-STED顯微系統，這是我國首創的顯微系統。它的研發難點主要在三激光合束。也就是要求三束激光的偏移誤差不能超過10納米。

這相當于三艘宇宙飛船在浩渺的空間進行準確對接。為了攻克這個難關，科研人員一頭扎進了暗室，不分白天黑夜地去做。有時候實驗結束，拉開窗簾的時候，發現外邊比屋里還要黑，因為已經是半夜了。

▲ 四光束三維超分辨成像

我們不僅做了核心物件，搭建了系統，同時還研發了具有自主知識產權的產品。這是我們研發的一款四光束干涉的三維超分辨顯微系統。

這套系統的用處很多，可以做活細胞成像，可以做藥物研發。這樣的一臺設備，國外同類的產品要賣到500萬元人民幣，而我們的售價只有國外的三分之一。

▲ 人體上皮細胞三維成像

這張圖就是這套系統拍攝的人體上皮細胞的三維圖，這是這套系統拍攝的肝癌活細胞在肝癌靶向藥物的作用下被殺死的過程。

▲ 靶向藥物作用肝癌細胞

藍色的是細胞核，外邊一圈粉色的是細胞膜外包裹的藥物。這個藥物進入到細胞里，然后把細胞殺死了。

有了這樣的系統，我們很高興，因為它可以加速我國肝癌靶向藥物的研發進度，讓更多的癌癥患者得到及時的治療和康復。

我很自豪，因為我們醫工所不僅做了核心部件，研發了系統，最重要的是，我們搭建了一個高精度超分辨顯微系統的研發平臺，這個平臺可以讓中國的生物學家、科學家定制自己的產品，做出世界領先的科研成果。同時我們的系統也賣到了美國、日本、以色列以及德國。

超分辨顯微系統的應用

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超分辨顯微系統雖然誕生只有二十幾年，但是它在各方面起到的作用都是非常大的。尤其在分子生物學和細胞生物學上，可以說是引起了革命性的變化。

▲ 傳統光學顯微鏡

展示一下超分辨顯微系統的魅力。這張圖是小白鼠大腦海馬區的一個超分辨顯微系統的觀測圖。這是常規系統拍攝的圖，實際一片模模糊糊。

▲ STORM

這是用超分辨顯微系統拍攝的同區域的圖，逐級放大很多之后，圖像依然很清晰。這張圖是用于阿爾茨海默病的研究的。

▲ SIM記錄的海馬神經元絲狀偽足的運動

這也是一張用超分辨顯微系統拍攝的海馬區神經元絲狀偽足運動的圖像。這種圖片可以讓我們知道人體是如何感受外邊的刺激，如何傳導信號的。

▲ 人體直腸癌組織切片

這是人體直腸癌組織切片的照片。左邊是共聚焦的圖，它最多只有200～300納米；右邊是它的囊泡里面蛋白質分布的照片。它非常清楚。通過右邊的這些照片，我們的科學家可以進一步闡述癌癥的發病機理。

▲ 人體宮頸癌細胞

這是人體宮頸癌細胞的一個圖片，細胞里不同的分子，不同的物質都能夠分得很清楚，這對我們的科研有著很重要的意義。

▲ 小鼠大腦神經元樹突

這是一個小鼠大腦神經元的樹突，也可以看清我們人體是如何思考，如何在放電。

做了30年的科研工作，我的體會就是如果你認準一個目標，就一定要堅持做下去。

這就像剛才說到的那位美國科學家，他不去接手家族企業，而是堅持做自己熱愛的研究，最終成為了一名諾貝爾獎獲得者。正是因為他一直堅持超分辨顯微系統的研發，最終他才取得了成功。

另外，我們科研工作者有一個夢想，那就是讓我們的產品真正走向世界，讓全世界都用上我們中國制造的超分辨顯微系統。讓全世界的科學家找到癌癥的發病機理，找到阿爾茨海默病的發病機理，研制出更多更好的藥物，服務于我們的健康。

文章轉載自“格致論道講壇”微信公眾號