神經(jīng)環(huán)路應(yīng)用（41）丨嚙齒動(dòng)物聽(tīng)覺(jué)刺激引發(fā)反應(yīng)

聽(tīng)覺(jué)刺激引發(fā)反應(yīng)通常涉及到使用特定的聲音或噪聲作為刺激，以引發(fā)實(shí)驗(yàn)對(duì)象（如人類或動(dòng)物）的特定反應(yīng)。這些反應(yīng)可以是行為上的，也可以是生理上的，例如腦電波的變化、肌肉的收縮或是身體動(dòng)作等。

動(dòng)物固定與適應(yīng)：將小鼠妥善固定在實(shí)驗(yàn)裝置上，使其頭部保持穩(wěn)定，便于進(jìn)行鈣成像監(jiān)測(cè)。在正式給予聽(tīng)覺(jué)刺激前，先讓小鼠在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)一段時(shí)間，使其狀態(tài)穩(wěn)定。

給予聽(tīng)覺(jué)刺激：按照設(shè)定好的參數(shù)，通過(guò)音響設(shè)備向?qū)嶒?yàn)箱內(nèi)播放相應(yīng)的聲音刺激，同時(shí)通過(guò)在體雙光子鈣成像系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠初級(jí)體感皮層桶狀區(qū)神經(jīng)元的鈣信號(hào)變化，記錄神經(jīng)元的活動(dòng)情況，包括神經(jīng)元的放電頻率、活動(dòng)強(qiáng)度等指標(biāo) 。

多次重復(fù)刺激：為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性，通常會(huì)對(duì)同一小鼠進(jìn)行多次聽(tīng)覺(jué)刺激實(shí)驗(yàn)，每次刺激之間保持一定的時(shí)間間隔，讓小鼠有足夠的時(shí)間恢復(fù)，同時(shí)在不同的小鼠身上重復(fù)該實(shí)驗(yàn)過(guò)程，以獲取更具普遍性的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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刺激配對(duì)范式具體步驟：

小鼠在雙光子顯微鏡下固定頭部，并呈現(xiàn)包括觸覺(jué)刺激、聽(tīng)覺(jué)刺激或聯(lián)合視聽(tīng)刺激的試驗(yàn)。觸覺(jué)刺激由步進(jìn)電機(jī)通過(guò)移動(dòng)桿穿過(guò)胡須，步進(jìn)電機(jī)旋轉(zhuǎn)一個(gè)完整的360度。電機(jī)以每秒1800度的角速度偏轉(zhuǎn)胡須。聽(tīng)覺(jué)刺激包括300毫秒的帶限噪聲爆發(fā)，頻率范圍有兩種：較低頻率范圍8.5-10.5 kHz（N1）和較高頻率范圍16.5-18.5 kHz（N2）。聽(tīng)覺(jué)刺激由數(shù)據(jù)采集板隨機(jī)生成，輸出采樣率為100kHz，并通過(guò)一個(gè)0.25W、8U揚(yáng)聲器播放，揚(yáng)聲器位于距離小鼠耳朵4.5厘米的位置。使用SilentStepStick TMC 2100步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)器控制步進(jìn)電機(jī)，以最小化聲噪。聯(lián)合視聽(tīng)刺激包括先是一個(gè)聽(tīng)覺(jué)刺激，然后大約30毫秒后是一個(gè)觸覺(jué)刺激接觸胡須。在一些額外的試驗(yàn)中，既不呈現(xiàn)聽(tīng)覺(jué)刺激也不呈現(xiàn)觸覺(jué)刺激。所有刺激都由Arduino微控制器觸發(fā)，它向步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)器和音頻信號(hào)發(fā)生器發(fā)出共同的TTL信號(hào)，以確保觸覺(jué)和聽(tīng)覺(jué)刺激之間的一致性延遲。在沒(méi)有胡須刺激的試驗(yàn)中（僅聲音和無(wú)刺激試驗(yàn)），桿從小鼠臉部移開(kāi)。總共呈現(xiàn)了6種不同的刺激條件：?jiǎn)为?dú)的胡須刺激（W）、單獨(dú)的噪聲1（N1）、單獨(dú)的噪聲2（N2）、胡須刺激加聲音1（W+N1）、胡須刺激加聲音2（W+N2）和無(wú)刺激（NS）。

小鼠在成像前一周適應(yīng)頭部固定。在適應(yīng)期間，掃描儀在目標(biāo)就位的情況下運(yùn)行，以使小鼠適應(yīng)雙光子設(shè)置的環(huán)境噪音。然后，在配對(duì)開(kāi)始的前一天，小鼠在預(yù)配對(duì)探針測(cè)試中接受所有刺激條件的隨機(jī)交錯(cuò)試驗(yàn)（每個(gè)條件100次試驗(yàn)）。在配對(duì)階段，未獎(jiǎng)勵(lì)范式中的小鼠接受了連續(xù)三天的配對(duì)試驗(yàn)，每個(gè)測(cè)試包括800次隨機(jī)交錯(cuò)的W+N1和N2試驗(yàn)（每個(gè)條件400次試驗(yàn)）。配對(duì)后，小鼠被呈現(xiàn)額外的隨機(jī)交錯(cuò)試驗(yàn)的后配對(duì)探針測(cè)試。

在獎(jiǎng)勵(lì)范式中，小鼠在配對(duì)前一周被限制飲水。除了適應(yīng)頭部固定外，通過(guò)每次小鼠舔舐時(shí)從舔口提供水來(lái)觀察行為。在所有條件的未獎(jiǎng)勵(lì)刺激的初始預(yù)配對(duì)之后，小鼠每天接受包括隨機(jī)交錯(cuò)的W+N1和W+N2試驗(yàn)的配對(duì)（每個(gè)條件400次試驗(yàn)）。使用連接到舔口的電容觸摸傳感器測(cè)量舔舐，配對(duì)期間的預(yù)期舔舐被量化為在追蹤間隔期間至少發(fā)生一次舔舐的概率。小鼠每天至少接受兩周的配對(duì)。如果小鼠在兩周結(jié)束時(shí)連續(xù)兩次測(cè)試的預(yù)期舔舐概率至少為0.7，則停止配對(duì)，并給予包括所有條件的隨機(jī)試驗(yàn)的后配對(duì)探針測(cè)試，不給予獎(jiǎng)勵(lì)。如果小鼠在兩周結(jié)束時(shí)過(guò)去兩天的預(yù)期舔舐概率低于0.7，則再給予一周的配對(duì)測(cè)試，之后給予后配對(duì)探針測(cè)試。

聽(tīng)覺(jué)腦干反應(yīng)記錄：

為了驗(yàn)證兩種聽(tīng)覺(jué)刺激在耳蝸和腦干水平上引起相似的反應(yīng)，配對(duì)完成后對(duì)每只小鼠進(jìn)行聽(tīng)覺(jué)腦干反應(yīng)記錄。麻醉小鼠，體溫維持在37.0°C。小鼠顱骨被削薄，以便將銀線電極直接植入大腦。參考電極插入左耳基部，尾巴接地。信號(hào)被一個(gè)20倍增益的電池供電前置放大器放大，然后通過(guò)一個(gè)Lynx放大器放大，增益設(shè)置為3004倍，低頻和高頻截止頻率分別為300 Hz和3000 Hz。每個(gè)刺激被呈現(xiàn)1000次，每個(gè)條件的數(shù)據(jù)在試驗(yàn)中平均。

記錄小鼠的行為，特別是胡須的運(yùn)動(dòng)。在聽(tīng)覺(jué)刺激過(guò)程中，持續(xù)記錄小鼠初級(jí)體感皮層桶狀區(qū)神經(jīng)元的鈣成像數(shù)據(jù)，以及與聽(tīng)覺(jué)刺激相關(guān)的各種參數(shù)信息，如聲音類型、強(qiáng)度、頻率、刺激時(shí)間等。

文獻(xiàn)引用：

• Kato DD, Bruno RM. Stability of cross-sensory input to primary somatosensory cortex across experience. bioRxiv [Preprint]. 2024 Aug 9:2024.08.07.607026.

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