科學通報 | 額外X染色體多維度影響男性胎兒生殖細胞發育

生殖健康依賴于胎兒生殖細胞(fetal germ cell, FGC)的正常發育, 在人類中, 這一過程受到復雜而精密的調控. 其中, X連鎖基因的劑量在人類FGC的發育過程中受到精確調節 [ 1 , 2 ] . 研究表明人類FGC在早期發育過程中存在X染色體重新激活(X-chromosome reactivation, XCR)的現象, 導致雌性FGCs中X連鎖基因的劑量約為雄性FGC的1.6倍 [2] . 與此同時雄性FGC中X連鎖基因與常染色體基因的表達比率低于1, 且該比率低于周圍體細胞中的水平 [3] , 這證明雄性FGC的發育需要相對較低劑量的X連鎖基因. 然而, 對于異常劑量的X連鎖基因如何損害人類FGC的發育, 目前仍知之甚少.

克氏綜合征(Klinefelter syndrome, KS)是男性最常見的性染色體異常疾病之一, 影響約1/600的男性群體 [4] . 這類患者比正常男性(46, XY)多出一條X染色體, 其染色體為(47, XXY), 其典型臨床表現為青春期后生殖細胞大量丟失、睪丸組織纖維化以及無精子癥, 導致生育能力嚴重受損 [5] . 既往研究多聚焦于患者青春期后階段, 此時生殖細胞已基本丟失, 目前僅記錄到性腺體細胞有限分子異常 [ 6 , 7 ] , 而KS患者不育的根本原因和起始事件, 尤其是生殖細胞早期發育缺陷及相關分子調控異常的機制尚不明確.

針對以上問題, 2024年, 北京大學第三醫院喬杰團隊在 Nature 發表題為“How the extra X chromosome impairs the development of male fetal germ cells”的研究論文. 該團隊基于前期發現的人類FGC在早期發育過程中存在XCR這一關鍵特征, 以KS患者FGC額外攜帶一條X染色體的特點作為天然研究模型, 以胎兒期生殖細胞研究為揭示發育異常的關鍵切入點, 揭示了X染色體劑量異常導致男性胎兒生殖細胞發育障礙的關鍵機制 [8] .

研究首先明確了KS患者的FGC在胎兒階段就出現了發育異常. 研究選用KS胎兒、男性和女性對照胎兒的性腺為研究對象, 進行后續多項研究. 單細胞轉錄組測序分析和免疫熒光染色發現, KS患者性腺中FGC處于早期階段的比例顯著高于男性對照. 與此同時, 兩組的FGC總數無顯著差異, 提示KS患者的FGC存在發育阻滯而非細胞丟失. 這一發現有力顛覆了將生殖細胞丟失主要歸因于青春期事件的傳統觀點, 證明發育障礙早在出生前就已發生.

進而, 該研究深入解析了KS患者的FGC的基因表達譜, 發現其存在顯著的基因調控失常. 在早期FGC中, 組蛋白修飾、WNT(wingless-related integration site)/TGF-β(transforming growth factor-β)、去甲基化等通路基因上調, 而分化相關基因, 如piRNA代謝、減數分裂相關基因則表達下調, 且NODAL信號增強、多能性提高等, 表明早期FGC多能性增強而分化潛能降低. 而在晚期FGC中, DNA復制、染色體分離相關基因上調, 表明細胞未完全進入有絲分裂停滯期, 同時遷移及早期FGC標志物上調, 向精原細胞過渡的關鍵基因下調, 整體顯示晚期FGC仍處于幼稚狀態.

與此同時, 研究團隊發現額外X染色體對KS患者的FGC的轉錄失調和發育缺陷具有關鍵影響. 首先, 研究團隊通過等位基因表達分析和免疫熒光染色證實了KS患者的FGC中兩條X染色體均處于活躍狀態. 隨后通過RNA/DNA/蛋白三重熒光原位檢測技術(triple in situ fluorescence, TISF)結合空間統計學算法深入探究了X染色體失活(X chromosome Inactivation, XCI)失敗的具體機制. 研究發現, 啟動XCI的長鏈非編碼RNA——X失活特異性轉錄本(X-inactive specific transcript, XIST)在KS患者的FGC中雖有表達, 并隨FGC分化逐漸下調直至消失, 但并未能介導XCI. 與此同時, 人類特異性長鏈非編碼RNA——X染色體活性涂層轉錄本(X-active coating transcript, XACT)在KS患者的FGC中表達更為廣泛, 同樣隨細胞分化而下調并消失. 既往研究表明, XACT可干擾XIST的表達與定位, 進而影響其功能 [ 9 , 10 ] . 本研究的空間共定位分析進一步發現, 在KS患者的FGC中, 部分XACT定位于XIST所形成的“云”狀結構內部, 提示XACT可能通過物理阻礙XIST附著于X染色體, 從而拮抗其沉默功能, 導致XCI無法發生. 結合其他人類FGC的研究數據, 推測FGC中XCI缺失的潛在機制可能還包括: XIST無法有效覆蓋X染色體、XACT的拮抗作用以及其他尚未闡明的機制. 此外由于存在兩條活躍的X染色體, KS患者的FGC中X連鎖基因的表達劑量遠高于男性對照, 早期為男性對照的1.68倍, 晚期為1.59倍. 值得注意的是, 上調的X連鎖基因顯著富集于大多數與FGC發育缺陷相關的關鍵通路中, 直接干擾WNT通路、組蛋白修飾、細胞周期等關鍵生物學過程, 并抑制X連鎖的癌/睪丸抗原(X-linked cancer-testis antigen genes, CTX)基因介導的精原干細胞分化程序, 最終損害KS患者的FGC發育.

此外, 研究發現KS患者的FGC表觀遺傳異常也可能是其發育阻滯的原因. 通過單細胞三組學測序(scTrio-seq)表征性腺細胞的DNA甲基化圖譜, 發現KS患者的FGC經歷異常的DNA甲基化重編程. KS早期FGC整體甲基化水平低于對照組, 且關鍵印記控制區經歷更徹底的擦除. 盡管基因表達與啟動子甲基化整體關聯有限, 但KS晚期FGC中 CTX 基因啟動子甲基化水平顯著升高, 可能導致其表達降低, 從而阻礙分化. 此外, KS患者的FGC中特定重復元件(SINE-VNTR-Alu, SVA)呈現高甲基化, 其異常表觀狀態可能參與發育阻滯 [ 11 , 12 ] .

生殖細胞發育不僅依賴內在基因程序, 也受周圍體細胞微環境的精細調控. 除發育阻滯外, 遷移受損是導致KS患者生殖細胞減少的另一關鍵因素. 在正常男性胎兒中, 支持細胞與晚期FGC于妊娠后期向睪丸索基底部遷移, 期間晚期FGC進一步分化為精原干細胞. 反之, 若無法完成遷移, 晚期FGC則會因分化異常死亡 [ 13 ~ 15 ] . 由此, 研究團隊通過單細胞轉錄組學(single-cell transcriptomics)技術, 描繪了KS患者的性腺體細胞的轉錄特征及其與FGC的相互作用. 結果表明, KS患者的分化支持細胞亞群(SC1和SC2)中, 與發育、遷移、黏附及細胞骨架相關基因表達顯著下調, 表明KS的支持細胞譜系存在缺陷, 其遷移和運動功能受到損害. 并且使用CellChat分析性腺細胞間的相互作用時發現, 除了WNT和TGF-β通路的過度激活外, 遷移相關的互作信號也顯著減少, 免疫熒光驗證了這種相互作用缺陷. 此外, 空間組學(stereo-seq)和免疫熒光顯示, 男性對照中的晚期FGC傾向于分布在生精小管的基底區域, 而KS患者中的晚期FGC則更傾向于分布在小管中心, 且KS患者的支持細胞核層厚度更大、晚期FGC基底分布比例更低, 證實支持細胞與FGC向基底膜的遷移受損.

最后, 該研究采用體外性腺培養系統探究KS患者FGC的分化能力及潛在的治療干預手段. 研究發現正常男性胎兒性腺組織在體外可以有效分化, 而KS胎兒性腺組織未出現分化. 但是, 當使用TGF-β抑制劑SB431542處理4例KS性腺組織后, 3例組織的分化能力顯著提升, 另1例也呈現上升趨勢, 證實了KS生殖細胞分化能力低下, 但靶向抑制TGF-β通路可有效改善其分化阻滯.

綜上所述, 該研究深入探究KS患者的生殖細胞發育異常, 首次系統揭示了額外X染色體通過多維度機制破壞男性生殖細胞發育的完整圖景, 探明了KS患者生殖細胞丟失的核心機制: KS患者的FGC中額外X染色體逃避失活, 導致X連鎖基因異常高表達, 進而引發一系列下游通路紊亂, 導致FGC發育阻滯; 同時, 表觀遺傳層面的異?？赡苓M一步加劇了阻滯. 此外, 支持細胞遷移能力的下降及細胞通訊減弱, 致使FGC無法向睪丸索基底部遷移, 造成遷移受損, 形成了“發育阻滯-遷移受阻”的惡性循環, 最終都會導致其出生后生殖細胞數量減少. 不僅如此, 該研究還創新性地提出靶向干預策略, 發現TGF-β抑制劑可以恢復KS性腺組織的分化能力, 改善發育障礙( 圖1 ).

圖1 額外X染色體多維度影響男性胎兒生殖細胞發育機制圖

值得注意的是, 盡管該研究取得了上述成果, 但仍存在若干有待完善之處, 這也為后續相關領域的深入探索指明了重要方向. 首先, 當前采用的體外培養系統是一個高度簡化且受控的環境, 雖能精確控制變量, 但與體內真實的睪丸微環境仍存在差異. 因此未來研究需建立更接近生理條件的模型或者開展臨床試驗, 以驗證TGF-β抑制劑在復雜微環境中的促分化效力. 其次, 研究提示TGF-β抑制劑對嵌合型KS患者可能同樣適用甚至更具潛力, 但這一假設仍需通過直接實驗驗證. 未來通過納入嵌合型患者樣本, 有望揭示其生殖細胞異質性對藥物響應的具體機制, 為該類患者的精準治療提供依據. 最后, TGF-β在多種生理過程中至關重要, 系統性抑制該通路可能會對生殖系統以外的器官或功能產生不良影響. 因此, 系統評估該抑制劑的潛在副作用及組織特異性安全性, 將是走向應用前不可或缺的一環.

然而該研究依舊填補了生殖發育生物學的重要空白, 開創了遺傳性不育癥的胎兒期機制解析與干預先河. 相信隨著未來研究的深入, 針對克氏綜合征等遺傳性不育癥的早期干預策略將逐步成熟, 最終實現從“機制解析”到“生育力挽救”的跨越.

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