科學(xué)通報(bào) | 敲除pina和pinb基因提高小麥籽粒硬度

近日，山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所李根英研究員領(lǐng)銜的小麥分子育種創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)在《科學(xué)通報(bào)》發(fā)表了題為“敲除pina和pinb基因提高小麥籽粒硬度”的研究論文。

小麥?zhǔn)鞘澜缛蠹Z食作物之一，是人類食物的主要來(lái)源。隨著經(jīng)濟(jì)的日益增長(zhǎng)和人民生活水平的不斷改善，人們對(duì)面制品加工品質(zhì)要求越來(lái)越高，優(yōu)質(zhì)專用小麥品種的需求越來(lái)越大，小麥品質(zhì)改良成為主要育種目標(biāo)。籽粒硬度是決定小麥加工品質(zhì)最重要的性狀之一，對(duì)小麥出粉率、淀粉損傷和面粉的吸水率以及谷物加工品質(zhì)具有重要的影響。小麥籽粒硬度主要是由位于5D染色體的兩個(gè)Pin基因決定的，包括Pina和Pinb基因，它們的編碼區(qū)均為447 bp，沒(méi)有內(nèi)含子，共同形成了小麥籽粒硬度的分子遺傳基礎(chǔ)。pina-D1a/pinb-D1a是普通野生型小麥中最常見(jiàn)的基因型，有一個(gè)基因發(fā)生突變都會(huì)導(dǎo)致籽粒變硬。硬度基因在我國(guó)普通小麥中存在多種變異類型，有pina突變導(dǎo)致PINA蛋白缺失，有pinb變異使核苷酸產(chǎn)生突變，種種變異類型都導(dǎo)致了胚乳硬度增加，進(jìn)而使籽粒硬度變大。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Pin等位基因有很多，除了pina缺失之外，其他都屬于單堿基突變，而含有這些突變類型的小麥材料，大多數(shù)的籽粒硬度都是相似的，SKCS硬度指數(shù)處于40-60之間，很難滿足優(yōu)質(zhì)面包生產(chǎn)對(duì)籽粒硬度和面粉吸水率的要求。

基于CRISPR/Cas9的基因組編輯技術(shù)的出現(xiàn)，為小麥提供了快速、準(zhǔn)確地創(chuàng)造更多新基因資源的機(jī)會(huì)。CRISPR/Cas9 技術(shù)具有載體構(gòu)建相對(duì)簡(jiǎn)單、靶向特異性高、而且可以多處打靶等特點(diǎn)，已經(jīng)在多個(gè)物種中成功實(shí)現(xiàn)了定點(diǎn)基因組編輯。小麥?zhǔn)钱愒戳扼w，基因組龐大，重復(fù)序列和基因拷貝數(shù)非常多，近幾年逐步建立了高效小麥遺傳轉(zhuǎn)化和基因編輯體系，對(duì)很多控制重要性狀的基因進(jìn)行了遺傳修飾，在提高產(chǎn)量、改良抗病、抗逆性方面創(chuàng)制了一批具有潛在應(yīng)用價(jià)值的新材料。

本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，對(duì)pina和pinb基因進(jìn)行敲除，根據(jù)sgRNA設(shè)計(jì)原則每個(gè)基因選擇了2個(gè)sgRNA。以冬小麥品種K35為轉(zhuǎn)化受體，分別構(gòu)建了單基因和雙基因編輯載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化獲得了基因編輯植株。利用Hi-TOM高通量測(cè)序法對(duì)T0、T1和T2代植株進(jìn)行連續(xù)的篩選和鑒定，獲得了pina、pinb基因的單突變體及雙突變體。用Sanger測(cè)序法進(jìn)一步鑒定了純合植株，得到了籽粒硬度提升的小麥新種質(zhì)，但是沒(méi)有影響植株生長(zhǎng)和其它農(nóng)藝性狀。利用掃描電鏡觀察野生型和突變體籽粒顯微結(jié)構(gòu)的差異，不同硬度的籽粒結(jié)構(gòu)是有差異的，突變體中的淀粉顆粒與蛋白質(zhì)基質(zhì)二者之間結(jié)合更加緊密。為了解析pina和pinb基因影響小麥籽粒硬度的分子機(jī)制，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選出差異表達(dá)的基因，并進(jìn)行了GO和KEGG pathway的富集分析，GO功能分類主要富集到生殖發(fā)育過(guò)程、胚胎發(fā)育、種子發(fā)育、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育等，KEGG富集基因主要集中在MAPK信號(hào)通路、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、半乳糖代謝、油菜素內(nèi)酯生物合成等過(guò)程。這說(shuō)明小麥籽粒硬度的形成和變化不是一個(gè)單一的過(guò)程，影響了多個(gè)代謝通路和途徑。

圖1基因編輯載體構(gòu)建

本課題組在前期工作中利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)pinb基因進(jìn)行精準(zhǔn)打靶，獲得了具有新優(yōu)異等位基因的小麥新種質(zhì)，其中春麥品種fielder的SKCS指數(shù)由18.2提高到73.4，顯著提高了其籽粒硬度，一步將軟質(zhì)小麥變成了硬質(zhì)小麥。該突變?cè)诰幋a區(qū)發(fā)生了34bp的缺失，是迄今為止在普通小麥pinb基因中出現(xiàn)的第一個(gè)大片段缺失材料，拓寬了小麥籽粒硬度改良的遺傳資源。但對(duì)于pina基因敲除的材料至今未見(jiàn)報(bào)道。不僅如此，上述研究中使用的受體是春性材料，很難作為育種親本應(yīng)用于冬小麥的新品種培育。因此，本研究以冬小麥K35作為受體材料，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)分別對(duì)pina和pinb基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除，獲得pina、pinb的單基因和雙基因突變體，創(chuàng)制了具有新型等位變異的優(yōu)異種質(zhì)材料，為研究小麥籽粒硬度形成的遺傳和生化基礎(chǔ)提供寶貴材料，為我國(guó)在籽粒硬度研究方面提供準(zhǔn)確信息，為選育優(yōu)質(zhì)專用小麥提供種質(zhì)資源，對(duì)其功能研究和小麥品質(zhì)改良均具有重要意義。

圖2 基因表達(dá)及籽粒硬度檢測(cè)

文章信息

張淑娟，高潔，楊路瑤，等。敲除pina和pinb基因提高小麥籽粒硬度. 科學(xué)通報(bào), 2025, 70 (16): 2588-2600. 2025-05-07.

https://doi.org/10.1360/TB-2024-1290

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