Science | 體外重構睪丸發育，干細胞“孕育”功能性精子

在哺乳動物中，性別決定依賴于性腺體細胞的分化，這些細胞營造出性別特異的環境，引導生殖細胞命運并確保生育能力。雖然遺傳性別在受精時已確定，但生殖細胞最初保持未分化狀態，在與性腺體細胞相互作用后才獲得雄性或雌性身份。在體外重建這一過程，將為研究性別決定機制提供強大平臺，并有望實現體外配子發生。然而，盡管在多能干細胞誘導原始生殖細胞樣細胞方面取得進展，但功能性睪丸微環境的重建仍是一項重大挑戰。

近日，《科學》雜志發表了由大阪大學和九州大學研究團隊（通訊作者：吉野剛博士、林克彥博士）完成的研究論文《Reconstitution of sex determination and the testicular niche using mouse pluripotent stem cells》。該研究成功利用小鼠多能干細胞，通過模擬體內性別決定過程，重構了功能性睪丸體細胞，并最終在體外培育出能夠產生健康后代的精子。

研究團隊首先構建了攜帶性染色體特異性報告基因（睪丸標記Sox9-GFP和卵巢標記Foxl2-tdTomato）的小鼠胚胎干細胞系。通過精準調控BMP和WNT信號通路，他們成功誘導細胞經歷雙向潛能狀態，并分化出睪丸支持細胞樣細胞。這一過程嚴格依賴于Y染色體的存在，只有XY細胞才能生成SOX9陽性細胞，并自發組裝成類似生精小管的管狀結構，周圍環繞著間質樣細胞。

單細胞轉錄組分析揭示了這一體外分化軌跡與體內性別決定過程高度相似。在分化第6天，一個雄性特異性的細胞群體（c10）涌現出來，該群體富集了Sry、Sox9、Amh和Dmrt1等對支持細胞分化和功能至關重要的基因。相比之下，雌性分化路徑則停留在另一細胞群體（c01），并表達Foxl2、Wnt4等卵巢相關基因。擬時序分析進一步描繪了支持細胞和基質細胞譜系的精確分化路徑。

研究進一步將誘導得到的睪丸體細胞樣細胞與同樣由干細胞誘導的原始生殖細胞樣細胞共培養，成功構建了睪丸類器官。在這個類器官中，原始生殖細胞樣細胞展現出完整的雄性分化進程：依次分化為前精原細胞、精原細胞，并最終進入減數分裂，成為精母細胞。同時，類器官內也觀察到了支持細胞、間質細胞和周肌樣細胞的分化與正確組裝，形成了功能性的睪丸微環境。

從這些睪丸類器官中，研究團隊成功分離并建立了可無限增殖的生殖干細胞樣細胞。將這些細胞移植到不育小鼠的睪丸中后，它們成功重建了精子發生過程，產生了形態完整、功能成熟的精子。通過單精子注射技術，這些精子使卵子受精，并最終獲得了健康且可育的后代。這一結果在多個獨立的細胞系中得到了驗證，證明了系統的可靠性和高效性。

利用該培養系統，研究人員還揭示了性別決定的固有不對稱性。當在誘導睪丸的條件下培養時，XX細胞無法產生SOX9陽性細胞，而是傾向于分化為FOXL2陽性細胞。反之，在誘導卵巢的條件下，XY細胞卻能高效產生FOXL2陽性細胞，并且這些細胞具備支持卵子發生的能力。這表明，盡管睪丸分化嚴格依賴Y染色體，但卵巢分化程序在XY細胞中并未被完全封鎖，揭示了雌雄性別決定通路根本性的不對稱。

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