Cell Stem Cell | 趙揚團隊系統解析“在體重編程”誘導心肌再生的關鍵病理障礙

2026年3月，北京大學趙揚研究組在干細胞和再生醫學領域知名期刊Cell Stem Cell上發表了題為“Perturb-seq uncovers pathological obstacles to direct cardiac reprogramming in vivo” 的研究論文。在這項研究中，研究者建立了一套專為研究在體微環境特異調控因子而設計的在體細胞命運擾動圖譜構建方案，繪制了心梗區域“在體重編程”誘導心肌再生的細胞命運轉化圖譜，并從140個候選因子中鎖定了首要障礙因子——鈣網蛋白（Calreticulin, CALR）。研究發現，心梗區域的應激響應激活CALR的表達，使其在內質網中大量駐留Ca2+，降低胞質鈣濃度和鈣信號活性，進而抑制了關鍵重編程因子MEF2C的活性。通過抑制CALR或激活鈣離子信號活性能顯著提升心肌重編程效率和誘導心肌細胞的質量。Calr敲低促進心梗后的在體重編程效率，促進心臟功能恢復，為心梗的再生醫療提供了理論基礎和有轉化前景的新靶點。

圖1. 基于細胞移植的在體Perturb-seq揭示“在體重編程”首要障礙因子CALR

心肌梗死是全球主要死亡原因之一，且發病率呈逐年上升趨勢，對患者生命造成重大威脅。由于成年哺乳動物心臟的再生能力極其有限，心梗區域的心肌因缺血壞死后取而代之的是心臟纖維化等病理過程。利用重編程因子將心梗區激活態心臟成纖維細胞“在體”原位誘導成為功能性心肌細胞，有望同時抑制心臟纖維化及實現心肌高效再生，是再生醫學領域的夢想。然而，“在體重編程”較之培養皿中誘導重編程的難度更大。趙揚研究組近年來深耕“在體重編程”的調控，報道了一系列可以提高心梗區激活成纖維細胞重編程效率的新因子和小分子，和周斌研究組合作利用嚴格的譜系示蹤系統對其進行系統觀測和驗證（Circulation, 2023; iScience, 2023; Front Cell Dev Biol, 2020）；以及進一步揭示心梗微環境中免疫細胞（巨噬細胞、T細胞）及心臟纖維化相關因子等調控在體重編程的分子機制（Protein & Cell, 2024; Life Medicine, 2026）。然而，復雜的病理微環境因素仍像一道道無形的屏障使得在體重編程仍遠達不到體外重編程的效果；而傳統的研究方法也只能先逐一提出候選因子假設，再依次開展基于譜系示蹤體系的動物實驗驗證；每個候選因子的在體研究都耗費大量時間和資源，并且難以同批對比大量不同候選因子。這也阻礙了“在體重編程”調控因子的快速解析及這一再生醫療策略從概念驗證走向轉化應用。

精準導航在體重編程誘導心肌再生的細胞命運擾動圖譜

為了精準定位在體重編程的層層“路障”，批量、系統地鑒定阻礙在體心臟重編程的關鍵因子，趙揚團隊建立了一套研究在體重編程的Perturb-seq技術流程。他們首先把目標范圍縮小在131個候選基因上——它們在病理環境中的表達量高于體外培養并被WGCNA分析判斷為節點基因，并同時加上9個已報道因子作為參照。隨后，將這140個因子的shRNA（每個候選因子選用2條shRNA，每條shRNA載體都帶有唯一的分子標簽）隨著重編程因子和熒光蛋白陣列式地轉導進入激活態心臟成纖維細胞內。研究者進一步把這些“同時植入多個重編程因子和不同分子標簽”的成纖維細胞混合移植進入另幾只小鼠的心梗區域，用Dox誘導重編程因子的表達，并分別在誘導重編程1周和2周時間點分離表達熒光蛋白的細胞樣品進行單細胞全轉錄組聯合分子標簽的RNA測序，進而成功構建了一張貫穿在體重編程全過程的“細胞命運擾動圖譜”。“陣列式感染+細胞移植”的設計確保了在體重編程因子遞送非常充分，且每種“擾動”的細胞比例也更為平均。

通過單細胞RNA測序分析，研究者首先系統性地繪制了從成纖維細胞向心肌細胞命運及其它亞型轉化的細胞命運圖譜。研究團隊發現，在心肌梗死的病理背景下，僅有小部分細胞向心肌命運演進。大量成纖維細胞由于微環境的干擾而陷入“病理”狀態，如特定亞群高表達干擾素響應基因。通過對這一細胞命運圖譜的深入解析，研究人員得以在分子水平上定義重編程過程中的不同細胞狀態，為后續尋找攔截細胞命運轉化的“幕后黑手”提供了高精度的細胞命運座標系。

通過分析擾動因子對應分子標簽的分布，這一圖譜清晰地展示了不同擾動因子對細胞命運走向的調控作用。通過計算每一個擾動因子在命運軌跡上的富集程度，研究人員發現，抑制特定的基因能夠顯著改變細胞的演化方向，使其繞過病理阻礙、更高效地誘導特定細胞亞群，包括誘導心肌細胞。這個圖譜還提供了將這100多個因子進行頭對頭對比的機會，可以針對任意細胞群排序候選調控因子的作用效果。

“罪魁禍首”——CALR，成纖維細胞向心肌轉分化的“剎車片”

在這一信息含量豐富的擾動圖譜中，鈣網蛋白（Calr）在心肌樣細胞群中高度富集，被鑒定為阻礙心肌樣細胞亞群產生的首要障礙因子。CALR通常定位于內質網，調控鈣離子的儲存和蛋白質折疊，同時也可以定位于胞質，是遞呈給巨噬細胞的“吃我”信號。研究人員發現，在心肌梗死區域的成纖維細胞中，CALR的表達水平顯著升高，且這一現象在人類心梗患者的樣本中同樣存在。這意味著，CALR的激活表達作為細胞應激后的反應，卻可能在“無意中”成為了心肌再生的“剎車片”。

上述猜想通過體內、外功能實驗得以驗證。研究團隊驗證了敲低 Calr能顯著提升體內和體外場景下的重編程誘導效率。更令人振奮的是，這種提升不僅體現在數量上，更體現在質量上：Calr的敲低使得誘導性心肌細胞在體外展現出前所未有的同步鈣信號振蕩，這意味著它們在功能上更接近功能性心肌細胞。此外，Calr敲低聯合其他重編程因子的共同作用下，原本極難被誘導為心肌的激活態心臟成纖維細胞實現了近70%的心肌誘導效率。在體重編程實驗也顯示，Calr敲低也同樣提高心肌樣細胞的在體誘導效率達一個數量級，達到10-20%。且在人類心臟成纖維細胞上，Calr敲低也同樣大幅提高重編程效率。

“機制揭秘”——病理應激激活Calr通過Ca2+信號調控MEF2C活性

那么，CALR是如何調控成纖維細胞向心肌命運的重編程呢？

研究團隊分析了多個線索，逐步將其定位于Ca2+信號通路的調控上。敲低CALR會導致內質網向胞質釋放Ca2+，引起胞質內Ca2+濃度的階段性提升。這種鈣信號的大幅提升激活了下游的CaM/CaMKIIδ通路。最為關鍵的是，無論是Calr敲低還是通過L型Ca2+通道激動劑提升胞內Ca2+濃度，都顯著增強了重編程核心轉錄因子MEF2C的轉錄活性，解釋了它們大幅提升重編程效率的原因。在某種程度上，Calr敲低或者Ca2+激活甚至可以替代外源MEF2C，借助心臟成纖維細胞中原本就內源低表達的MEF2C，并通過加強其活性來驅動成纖維細胞跨越命運鴻溝，順利向心肌細胞轉化。這一機制還將胚胎時期的心肌發育機制與病理環境下的再生過程聯系了起來，證明了“重啟”發育程序是實現高效再生的有效途徑。

圖2. 應激信號通過調控鈣離子濃度的時空調控影響心臟重編程的機制解析

技術革新與未來展望

該研究是首次將perturb-seq應用于“在體重編程”的研究，為“在體重編程”領域尋找更多調控靶點提供了新的技術框架，提示了直接在病理環境下研究在體重編程的重要性。尤其該研究繪制了心臟成纖維細胞向心肌以及多個成纖維細胞亞群之間命運轉化的調控因子圖譜；對大量候選因子進行了在體重編程效果的“頭對頭”對比；揭示了CALR在“在體重編程”誘導心臟修復再生中的核心作用及其通過調控Ca2+通路進而作用于細胞命運核心轉錄因子活性的分子機制。這一進展為治療心梗“在體重編程”策略提供了堅實的科學依據，并提供了具有臨床應用潛力的新靶點。

北京大學未來技術學院分子醫學研究所蔡依泓（2022級博士生）、楊洋（博士后）、楊峻博（2019級博士生）為論文共同第一作者，北京大學趙揚研究員為通訊作者。研究團隊受天然藥物及仿生藥物全國重點實驗室、細胞增殖與分化教育部重點實驗室、細胞穩態及衰老性重大疾病北京市研究中心、北京大學生命科學聯合中心、北京大學臨床醫學高等研究院、北京大學未來技術學院等單位支持。該研究獲國家重點研發計劃重點專項（2025YFA0922000；2018YFA0800500）及國家自然科學基金（32470882）等資金支持。

編輯 | VOX

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