Molecular Cell | 天津醫(yī)科大學(xué)張恒團隊揭示新型DNA編輯系統(tǒng)“TIGR-TasH”分子機制

在基因組編輯技術(shù)快速發(fā)展的今天，CRISPR-Cas系統(tǒng)因其高效、便捷而廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域。然而，這種系統(tǒng)大多依賴單一的引導(dǎo)RNA（crRNA）識別并切割DNA的一條鏈，另一條鏈則由蛋白結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割。相比之下，新近發(fā)現(xiàn)的TIGR系統(tǒng)采用了獨特的雙間隔序列（dual-spacer）結(jié)構(gòu)，其引導(dǎo)RNA（tigRNA）能夠同時識別靶標(biāo)DNA的兩條鏈，這一特性為開發(fā)新型基因編輯工具提供了新的可能。然而，TIGR系統(tǒng)如何實現(xiàn)RNA加工、復(fù)合物組裝及靶標(biāo)切割的分子機制仍不清晰。

2026年3月13日，天津醫(yī)科大學(xué)張恒教授團隊在《Molecular Cell》期刊發(fā)表了題為《Molecular basis for dual-spacer-guided target cleavage by the TIGR-TasH system》的研究論文。該研究通過解析六個高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)揭示了TIGR-TasH系統(tǒng)的工作機制，包括tigRNA加工、靶標(biāo)DNA解旋、HNH核酸酶募集及切割特異性的分子基礎(chǔ)。

研究人員首先發(fā)現(xiàn)，TasH蛋白能夠在無輔助因子條件下自主加工前體tigRNA，其Nop結(jié)構(gòu)域中的保守組氨酸和酪氨酸殘基是切割活性的關(guān)鍵。與依賴宿主因子的TasR系統(tǒng)不同，TasH展現(xiàn)出獨立的RNA加工能力，為開發(fā)無需額外因子的RNA編輯工具提供了新思路。

在靶標(biāo)DNA結(jié)合過程中，TasH通過其Nop結(jié)構(gòu)域中的α4螺旋插入DNA雙鏈之間，保守的賴氨酸K211觸發(fā)DNA解旋，色氨酸W203則穩(wěn)定RNA-DNA異源雙鏈的形成。該“賴氨酸-色氨酸”對的功能類似于CRISPR系統(tǒng)中的PAM識別域，揭示了TIGR系統(tǒng)獨特的DNA解旋機制。

進一步的結(jié)構(gòu)分析顯示，TasH通過β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)精確招募HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域。該β-發(fā)夾與tigRNA中的保守box C基序以腺嘌呤依賴方式相互作用，若將box C中的腺嘌呤替換為其他堿基，則β-發(fā)夾構(gòu)象改變，HNH無法正確定位，導(dǎo)致切割失活。這一發(fā)現(xiàn)為設(shè)計RNA定義的核酸酶而非傳統(tǒng)蛋白突變型核酸酶奠定了基礎(chǔ)。

研究還發(fā)現(xiàn)，TasH對靶標(biāo)DNA長度具有嚴(yán)格選擇性，偏好16個堿基對的底物。若在靶標(biāo)兩端引入額外堿基對，β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)會產(chǎn)生空間位阻，阻止切割復(fù)合物的形成。與此不同，TasR系統(tǒng)因缺乏該β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)，可切割更長的底物。這表明β-發(fā)夾是決定TasH底物特異性的關(guān)鍵元件。

基于上述機制，研究團隊進一步展示了通過改造box C基序?qū)崿F(xiàn)鏈特異性切割的可能性。當(dāng)分別突變兩個box C中的腺嘌呤時，TasH僅在對應(yīng)鏈上產(chǎn)生切口。將這兩種突變體tigRNA共表達于哺乳細(xì)胞中，可有效誘導(dǎo)雙鏈斷裂并激活綠色熒光蛋白表達，證實了tigRNA定義的核酸酶活性，為基因編輯工具設(shè)計提供了全新策略。

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