Mol Cell |?基因剪刀Cas9的“第二人生”—肖易倍/駱敏/陸美玲/李兆星揭示Cas9參與CRISPR記憶生成的機制

提起CRISPR-Cas9， 很多人的第一反應都是 “基因 魔剪 ” —— 識別 靶標 、精準切割，改寫基因組。但在細菌的CRISPR免疫系統里，決定“能不能精準出刀”的，往往不是切割，而是更早一步的適應階段 （adaptation）—— 把外源DNA的一小段片段篩選、加工并整合進CRISPR陣列，形成可遺傳的“免疫記憶”。

CRISPR-Cas系統通過將外源DNA片段寫入宿主CRISPR陣列，建立可遺傳的“免疫記憶”。在這一 過程中 ，系統不僅要從海量外源DNA中優先鎖定帶PAM線索的候選片段，還要將其加工成合規的spacer長度并保證方向性整合，才能為后續干擾階段的精準識別打下基礎。然而，在典型II-A型CRISPR系統中Cas1本身并不具備PAM識別能力，這使得“PAM如何被識別并與prespacer選擇耦聯”長期缺乏直接證據。

2026年2月16日 ，中國藥科大學肖易倍團隊 和新加坡國大 學駱敏團隊 的合作 在MolecularCell發表題為Structural basis for Cas9-directed spacer acquisition in type II-A CRISPR-Cas systems的研究論文 ，通過解析II-A CRISPR系統中關鍵適應復合體的多種冷凍電鏡結構，闡明該系統中所有四個蛋白，Cas9與Csn2、Cas1-Cas2組裝成超級復合體共同完成這一系列流程的分子機制。研 究發現：Cas9在適應階段并非單純“出手切割”，而是承擔前端“偵察 —— 篩查”的關鍵節點功能，與Csn2共同完成PAM掃描與prespacer定標，并通過“退出”觸發整合模塊重排，最終將合格片段交由Cas1–Cas2寫入CRISPR陣列。

研究團隊首先在體外穩定重構了Cas9、Csn2與Cas1–Cas2的四蛋白復合體，并捕捉到其apo狀態的“休眠/待命”構象。該超級復合體中Cas9的關鍵結構域（尤其與活化相關的REC3區域）被Csn2與Cas1–Cas2界面約束在更為閉合的待機構象中，與實驗觀察到的Cas9 在 Csn2與Cas1–Cas2 存在的條件下 切割活性顯著降低相一致，提示該裝配形態更偏向于DNA偵察與候選片段篩查，從而避免適應階段的非特異損傷。

為追蹤PAM選擇過程，研究團隊設計了不與crRNA互補但含單一PAM的dsDNA底物。在DNA加入后，原先體積龐大的超級復合體發生顯著重排，形成更緊湊的 前間隔序列（ prespacer ）捕獲復合物 。在該狀態下，Cas9與DNA形成可滑動、可檢驗 序列 的結合方式，提示Cas9可沿DNA進行 P AM掃描驗證，并以PAM為關鍵判據鎖定合格候選片段。

更為關鍵的是，結構顯示dsDNA末端被導入Csn2的中心通道，并與復合體構型共同形成一種“導流槽 + 尺子”式的幾何約束。在這一約束下，候選DNA片段被定標為約30 bp的標準長度，恰好匹配可被Cas1–Cas2整合的 前間隔序列的長 度。由此，Cas9負責PAM線索的掃描與驗收，Csn2負責末端捕獲與長度定標，兩者協同將“可用材料”精準交付給 C as1-Cas2整合模塊。

研究還捕捉到缺失Cas9的相關結構狀態。值得注意的是，Cas9的“退場讓路”并非簡單解離，而是伴隨Csn2–Cas1–Cas2裝配體發生重排：原先受約束的PAM近端DNA被暴露出來，使Cas1–Cas2能夠更順暢地裝載并進入后續的 前間隔序列 加工與方向性整合步驟。這一結構開關機制為理解II-A型系統如何完成PAM依賴選擇與整合前準備，提供了關鍵線索。

綜上，該研究在結構層面串聯了II-A型CRISPR適應階段的關鍵事件：休眠態復合體先將Cas9限制在低切割的待機姿態；游離的DNA末端被Csn2捕獲后傳導至Cas9，隨后Cas9沿DNA滑動掃描并識別PAM序列；Csn2和Cas9共同將候選片段定標至約30 bp；隨后Cas9解離觸發裝配體重排，暴露PAM近端DNA并促使Cas1–Cas2接管完成整合。這不僅重新定義了Cas9在細菌免疫中的角色，也為理解CRISPR記憶生成的“質量控制”提供了新的結構框架。

中國藥科大學藥學院 肖易倍 教授、生命科學院 陸美玲 副教授和新加坡國立大學駱敏教授為共同通訊作者，中國藥科大學藥學院 李兆星 研究員 、 博士研究生 李 鈺 濤為共同第一作者。 此外。中國藥科大學陳美容教授；研究生孔健平、吳宛倩、黃平平、曾婷、武倩倩、張煜；本科生劉勇峰、林瀚豐、侯力裘、劉宮羽，新加坡國立大學胡純一教授、何雨瞳博士，以及艾迪貝克楊振煌博士對本課題的完成均付出了重要的貢獻。

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2026.01.024

制版人： 十一

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