研究解讀：基于WES與ctDNA測序揭示內(nèi)分泌治療耐藥乳腺癌的基因組進(jìn)化圖譜

引言

激素受體陽性/人表皮生長因子受體2陰性（HR+/HER2-）乳腺癌在乳腺癌亞型中占比較高，但約20-40%的患者在接受輔助內(nèi)分泌治療后會發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，且絕大多數(shù)轉(zhuǎn)移性病例最終發(fā)展為耐藥[1]。此前，發(fā)表在Breast Cancer Research and Treatment雜志的一項(xiàng)研究[2]中采用全外顯子組測序（WES）技術(shù)，對配對的初治與復(fù)發(fā)部位腫瘤組織及胚系DNA進(jìn)行了深度分析，并結(jié)合自研的336基因靶向二代測序技術(shù)對循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）進(jìn)行檢測，旨在全面繪制內(nèi)分泌治療耐藥型與敏感型患者的基因組圖譜，從而深入剖析治療耐藥的內(nèi)在與獲得性分子機(jī)制。

研究方法

本研究為單中心前瞻性研究，收集了經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)為乳腺癌的患者的樣本和數(shù)據(jù)，這些患者經(jīng)免疫組化檢測為ER和/或PR陽性，且經(jīng)免疫組化或熒光原位雜交檢測為HER2陰性。所有早期或局部晚期乳腺癌（LABC）患者均接受了標(biāo)準(zhǔn)根治性治療，包括手術(shù)，聯(lián)合或不聯(lián)合（新）輔助化療、放療（如有指征）以及輔助內(nèi)分泌治療。如果患者在開始內(nèi)分泌治療后至少2年內(nèi)無復(fù)發(fā)，則被歸類為內(nèi)分泌治療敏感型。采集了這些患者診斷時的血液、口腔拭子樣本和先前存檔的腫瘤組織。如果在內(nèi)分泌治療期間出現(xiàn)疾病進(jìn)展或在開始內(nèi)分泌治療2年內(nèi)出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)，則患者被歸類為內(nèi)分泌治療耐藥型疾病。同樣收集了這些患者的血液、口腔拭子和最易獲取的復(fù)發(fā)部位的腫瘤組織（圖1）。

圖1. 研究設(shè)計(jì)和患者招募流程圖[2]

研究結(jié)果

患者隊(duì)列及基線特征

分析納入了2017年至2023年間招募的334例患者，其中135例患有內(nèi)分泌治療耐藥型疾病，199例患有內(nèi)分泌治療敏感型疾病。在這334例患者中，有298例患者（耐藥119，敏感179）可獲得血漿樣本，其中254例患者（耐藥116，敏感138）檢測到血漿核酸。254例患者中的250例（耐藥116，敏感134）檢測到細(xì)胞游離DNA（cfDNA，定義為50-700bp）。250例患者中的136例（耐藥116，敏感24）檢測到ctDNA（定義為50-350bp），其中118例患者（耐藥98，敏感20）其50%的cfDNA片段長度介于50-350bp之間，表明ctDNA富集。內(nèi)分泌治療耐藥型患者中ctDNA的檢出率更高，116例耐藥患者中有98例（84.5%）檢測到ctDNA，而138例內(nèi)分泌治療敏感型患者中僅有20例（14.5%）檢測到。

19例內(nèi)分泌治療耐藥型患者擁有配對體細(xì)胞樣本（初治和復(fù)發(fā)腫瘤）的WES數(shù)據(jù)，其中7例耐藥患者同時擁有可用的ctDNA NGS數(shù)據(jù)。因此，最終分析集包含66例患者（耐藥47，敏感19）的NGS數(shù)據(jù)，包括12例僅有配對體細(xì)胞組織的耐藥患者，28例僅有ctDNA數(shù)據(jù)的耐藥患者，7例同時擁有配對體細(xì)胞組織和ctDNA數(shù)據(jù)的耐藥患者，以及19例僅有ctDNA數(shù)據(jù)的敏感患者。

所有患者均為女性，中位年齡51（27-70）歲，從入組到最后一次隨訪的中位隨訪時間為57個月。耐藥組患者 vs. 敏感組患者，在樣本采集時的III級腫瘤比例（76.5% vs. 47.1%）和IV期疾病比例（39% vs. 2%）更高。除1例在初次就診時即患有原發(fā)性轉(zhuǎn)移性疾病且伴有多器官轉(zhuǎn)移的患者外，所有患者均接受了根治性手術(shù)。內(nèi)分泌治療耐藥型疾病患者在樣本采集時已接受了中位數(shù)為三線的系統(tǒng)治療。5例患者曾接受過CDK4/6抑制劑治療。在絕經(jīng)前亞組中，8例患者接受了卵巢功能抑制。

內(nèi)分泌治療耐藥患者初治和治療后復(fù)發(fā)腫瘤的WES結(jié)果

總體而言，治療后復(fù)發(fā)腫瘤的突變率（中位數(shù)0.883突變/mb，范圍0.51–3.41）高于初治診斷腫瘤（中位數(shù)0.655突變/mb，范圍0.31–2.09）（p值0.03）。

針對19例患者的38個腫瘤樣本（包括初治和復(fù)發(fā)部位組織），在1608個基因中識別了1886個獨(dú)特的體細(xì)胞變異，其中1562個基因中的1810個突變被注釋為具有功能影響。經(jīng)歐洲腫瘤內(nèi)科學(xué)會分子靶點(diǎn)臨床可操作性量表（ESCAT）分析，將1810個突變中的64個注釋為已確認(rèn)的驅(qū)動突變（圖2）。初治樣本中驅(qū)動突變的中位數(shù)為2個，復(fù)發(fā)腫瘤中為3個；31個驅(qū)動突變同時存在于初治和復(fù)發(fā)部位樣本中，12個突變在復(fù)發(fā)時丟失，而21個驅(qū)動突變在復(fù)發(fā)時獲得，包括ESR1、PIK3R2、ATR、EZH2和POLE等基因中的潛在可靶向改變。

圖2. ESCAT分析確定的19例內(nèi)分泌治療耐藥患者的可靶向驅(qū)動突變[2]

內(nèi)分泌治療耐藥患者腫瘤組織的克隆進(jìn)化模式

內(nèi)分泌治療耐藥患者的初治腫瘤樣本呈多克隆性，突變負(fù)荷各異（圖3），由一個原始克隆分化為亞克隆（圖4）。這種“分支進(jìn)化”模式在18例（94.7%）患者中觀察到。其余1例（5.3%）患者的初治腫瘤為雙克隆，并在復(fù)發(fā)時保持不變。我們根據(jù)原始克隆中是否存在PIK3CA和/或TP53突變對患者進(jìn)行分類。13例（68.4%）患者的原始克隆攜帶PIK3CA或TP53突變，或兩者兼有。A組患者包括3例（15.8%）原始克隆中同時存在TP53和PIK3CA突變的患者（圖4A），這些患者的原始克隆中缺乏其他驅(qū)動突變，表明PIK3CA和TP53突變在其整個臨床過程中且持續(xù)存在，驅(qū)動治療耐藥。這3例患者中的1例（5.3%）（P038R）在復(fù)發(fā)時獲得了ESR1突變（p.Y537S）。B組患者包括3例（15.8%）僅攜帶TP53突變且無PI3K通路突變的患者（圖4B）。這些患者的原始克隆中有額外的GATA3、RAD54和AMER1突變。C組包含8例（42.1%）患者，其原始克隆中僅有PIK3CA突變，而無TP53突變（圖4C）。其中5例（26.3%）患者的原始克隆中存在其他原癌基因（JAG1、RAF1、KRAS和FOXA1）的額外突變；2例（10.5%）患者存在DNA損傷修復(fù)（DDR）基因（RAD18、XRCC5）、原癌基因（MAP3K21、MAP2K5、PDGFRL）和抑癌基因（PTEN）的突變；1例（5.3%）患者存在ESR2突變（R220W）；1例（5.3%）患者在復(fù)發(fā)時獲得了兩個TP53突變（R141C和E66X）。D組包含5例（26.3%）患者，其原始克隆中缺乏TP53或PIK3CA突變（圖4D），但存在FOXA2、NOTCH1、PTEN、GATA3、MEN1、FRG1和MAP3K等已知驅(qū)動突變。2例（10.5%）D組患者的復(fù)發(fā)部位腫瘤組織獲得了一個ESR1熱點(diǎn)突變。此外，在2例（10.5%）患者（P080R和P069R）中，原始克隆中未發(fā)現(xiàn)任何已知的驅(qū)動突變。

圖3. 19例患者配對初治和復(fù)發(fā)部位組織活檢WES數(shù)據(jù)中各克隆的突變分布[2]

圖4. 18例具有初治和復(fù)發(fā)部位組織活檢WES數(shù)據(jù)患者的克隆圖譜[2]

ctDNA靶向NGS識別出乳腺癌標(biāo)志性突變

在54例具有ctDNA NGS數(shù)據(jù)（耐藥35，敏感19）的患者中，53例（耐藥35，敏感18）至少有一個變異通過了硬過濾（根據(jù)一定的邏輯原則，對注釋結(jié)果中特定列信息進(jìn)行篩選，通常為閾值或類篩選，盡可能縮小候選變異范圍），共有23,113個獨(dú)特變異。其中12,761個為同義突變或被注釋為“未知”，因此從進(jìn)一步分析中剔除；而10,352個被注釋為“非同義”、“移碼”、“終止缺失”或“終止獲得”的變異被進(jìn)一步分析。其中，805個在單核苷酸多態(tài)性（dbSNP）數(shù)據(jù)庫和癌癥體細(xì)胞突變目錄（COSMIC）中均不存在，表明它們可能是種族特異性的胚系多態(tài)性；而2328個變異僅存在于dbSNP中，表明它們是胚系多態(tài)性。在這2328個可能的胚系多態(tài)性中，11/54（20.4%）例患者在7個基因（BRCA1、CHEK2、MLH3、MMP9、SOX2、AR和ZFHX3）中的變異被注釋為致病性或可能致病性。在10,352個變異中，7219個存在于COSMIC中，其中6969個被注釋為“良性”、“可能良性”或“致病性不確定”，被排除在進(jìn)一步分析之外；而53例患者中7219個變異里的250個被注釋為“致病性”或“可能致病性”，并進(jìn)行了進(jìn)一步分析。在這250個變異中，170個出現(xiàn)在超過30例患者中，表明它們可能是多態(tài)性，因此從進(jìn)一步分析中排除。

在剩余80個致病變異中，有22個基因的42個獨(dú)特變異存在于35例內(nèi)分泌治療耐藥患者中的32例中。在這35例患者中，15例（42.9%）有PIK3CA熱點(diǎn)突變，9例（25.7%）有TP53熱點(diǎn)突變，3例（8.6%）兩者皆有。ESCAT分析確定，42個變異中有12個基因的27個變異在25例（71.4%）耐藥患者中是可靶向的。耐藥患者中任意可靶向的驅(qū)動改變包括PIK3CA p.H1047X、AKT1 p.E17K、CDH1 p.R63X、CDKN2A p.X50*、ERBB2 p.D769Y、ESR1 p.E380Q、GATA3 p.R367X、KRAS p.G12A、KRAS p.G12D、PTEN p.D24H和SF3B1 p.K700E。

在19例內(nèi)分泌治療敏感患者中，10例（52.6%）中發(fā)現(xiàn)了8個基因的10個獨(dú)特致病變異。3例（15.8%）出現(xiàn)PIK3CA熱點(diǎn)突變，1例（5.3%）出現(xiàn)TP53熱點(diǎn)突變。通過ESCAT分析，這10個變異中有3個基因的4個變異在6例敏感患者中被確定為驅(qū)動突變，包括PIK3CA p.H1047X和KRAS p.G12A。

因此，總體而言，這54例患者中有31例（耐藥27，敏感4，57.4%）攜帶PIK3CA或TP53突變，其中28例（耐藥25，敏感3，51.9%）患者可見潛在的可靶向改變。

ctDNA NGS檢測可檢測胚系BRCA1變異

在ctDNA分析中，3例（耐藥1，敏感2，5.6%）患者攜帶致病性BRCA1變異，而1例（1.9%）耐藥患者攜帶致病性BRCA2變異。一例敏感患者的一個致病性BRCA1變異僅標(biāo)注了dbSNPID，表明這可能是一個胚系變異；該患者也報告了乳腺癌家族史。其他兩個BRCA1變異（耐藥1，敏感1）和耐藥患者中唯一的BRCA2變異也存在于COSMIC數(shù)據(jù)庫中，表明它們可能是體細(xì)胞或胚系變異，由于缺乏口腔拭子DNA作為胚系對照，無法確認(rèn)。

ctDNA中存在驅(qū)動突變增加后續(xù)復(fù)發(fā)風(fēng)險

在19例內(nèi)分泌治療敏感患者（采血時影像學(xué)和臨床均無病）中的10例（52.6%）的ctDNA中檢測到了TP53、KRAS、PIK3CA、BRCA1、SF3B1、AR、MSH6和MEN1的已知驅(qū)動突變。在這10例患者中，8例在分析時存活且無病，其他2例中一例攜帶已知的MEN1致病突變，另一例攜帶PIK3CA和KRAS兩個驅(qū)動突變，經(jīng)歷了疾病復(fù)發(fā)并死亡。在9例ctDNA分析中未發(fā)現(xiàn)任何已知驅(qū)動突變的患者中，1例失訪，其余8例（占無驅(qū)動突變者的88.9%）在分析時存活且無病。

組織活檢中的驅(qū)動突變在ctDNA NGS檢測中復(fù)現(xiàn)

7例患者擁有配對（初治和復(fù)發(fā)部位）體細(xì)胞腫瘤組織及復(fù)發(fā)時ctDNA的NGS數(shù)據(jù)。體細(xì)胞組織中共有1608個獨(dú)特基因發(fā)生突變，其中59個基因包含在靶向ctDNA面板中。在7例（100%）患者的腫瘤組織中，有7個基因通過ESCAT分析檢測出10個驅(qū)動突變。在1例（14.3%）患者中，2個驅(qū)動突變僅在初治樣本中檢測到，而在復(fù)發(fā)部位組織和ctDNA中缺失；在2例（28.6%）患者中，2個驅(qū)動突變僅在復(fù)發(fā)部位組織中檢測到，而在復(fù)發(fā)時的ctDNA中缺失；在1例（14.3%）患者中，1個驅(qū)動突變在復(fù)發(fā)部位組織和復(fù)發(fā)時的ctDNA中均被檢測到；在4例（57.1%）患者中5個驅(qū)動突變（均存在于這些患者的原始克隆中）在初治和復(fù)發(fā)部位組織以及復(fù)發(fā)時的ctDNA中均被檢測到。患者P068R和P038R原始克隆中的FOXA1和ESR1驅(qū)動突變未在相應(yīng)的ctDNA樣本中識別出來。

可靶向突變圖譜

總體而言，研究共納入66例（耐藥47，敏感19）具有可分析NGS數(shù)據(jù)的患者，其中在47例（耐藥40，敏感6，71.2%）患者的至少一種檢測（WES或ctDNA，圖5）中識別出16個基因的47個獨(dú)特的可靶向驅(qū)動突變。

圖5. ESCAT分析確定的66例患者（結(jié)合WES和ctDNA數(shù)據(jù)）的可靶向驅(qū)動突變[2]

在47例內(nèi)分泌治療耐藥患者中，6例（12.7%）同時具有PIK3CA和TP53熱點(diǎn)突變，14例（29.7%）僅有PIK3CA突變，4例（8.5%）僅有TP53突變。因此，24例（51.1%）內(nèi)分泌治療耐藥患者攜帶PIK3CA或TP53突變，5例（10.6%）耐藥患者攜帶ESR1突變，2例（4.3%）耐藥患者各攜帶PTEN、CDKN2A或KRAS突變，而各有一例（2.1%）耐藥患者攜帶BRCA1、BRCA2、SF3B1、ERBB2、AKT1或ATR突變。

在19例內(nèi)分泌治療敏感患者中，沒有患者同時具有TP53和PIK3CA突變，4例（21.1%）僅有PIK3CA突變，3例（15.8%）僅有TP53突變。總體而言，在66例患者的整個隊(duì)列中，6例（9.1%）具有PIK3CA和TP53基因突變，18例（27.3%）患者僅有PIK3CA突變，7例（10.6%）患者僅有TP53突變。

小結(jié)

本研究通過對內(nèi)分泌治療耐藥及敏感乳腺癌患者進(jìn)行WES和高深度ctDNA測序，揭示了耐藥腫瘤在診斷及復(fù)發(fā)時表現(xiàn)為多克隆特征，并遵循分支進(jìn)化模式。研究發(fā)現(xiàn)，包含TP53和/或PIK3CA突變的原始克隆可能共存并持續(xù)存在，其中TP53突變可能足以驅(qū)動轉(zhuǎn)移克隆的播種，而PIK3CA突變往往需協(xié)同其他基因改變以促進(jìn)增殖；相比之下，ESR1突變主要在復(fù)發(fā)時獲得。臨床轉(zhuǎn)化方面，71%的耐藥患者在復(fù)發(fā)時的ctDNA中存在可靶向突變，且激素敏感型患者ctDNA中驅(qū)動突變的檢出與復(fù)發(fā)風(fēng)險顯著相關(guān)，證實(shí)了液體活檢在指導(dǎo)精準(zhǔn)治療及疾病監(jiān)測中的重要價值，尤其適用于難以進(jìn)行組織活檢的病例。

技術(shù)層面上，10,000×深度的ctDNA測序?qū)ψR別TP53、PIK3CA等原始克隆驅(qū)動突變具有高靈敏度，但在捕獲復(fù)發(fā)時低頻亞克隆突變（如ESR1）方面可能存在局限，未來更高深度（50,000×–100,000×）的測序可能有助于更全面地評估突變負(fù)荷。盡管本研究在樣本量和部分配對數(shù)據(jù)上存在一定局限，但基于臨床表型明確的隊(duì)列分析，強(qiáng)調(diào)了早期靶向原始克隆的重要性，并表明中等覆蓋度的ctDNA測序雖不能完全替代組織檢測，但作為一種極具潛力的非侵入性工具，能有效提供關(guān)鍵的臨床基因組信息。

參考文獻(xiàn)

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Commun Biol

2.Chaubal R, et al. Genomic landscape of hormone therapy-resistant HR-positive, HER2-negative breast cancer.

Breast Cancer Res Treat

審批編號：CN-178599

有效期至：2027-02-05

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撰寫：Citrea

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