NAR?|?孫青原/歐湘紅/孟鐵剛/蘇瑞寶團隊揭示RNA G-四鏈體在卵子發育及雌性生殖中的作用及機制

在基因表達調控領域， RNA G- 四鏈體結構（ rG4s ）長期以來呈現出一個令人困惑的矛盾現象：體外高通量測序研究顯示 rG4 在體外條件下廣泛形成，但在活細胞內卻主要處于解折疊狀態；然而，細胞成像實驗和內源基因表達研究卻清晰展示了 rG4 的形成及其功能。這種“ 體外豐富 - 體內稀缺” 的矛盾提示， rG4 結構可能受到精密的動態調控，但這種調控的本質、分子機制及其生理病理意義尚不清楚。傳統觀點認為， RNA 解旋酶如 DHX36 的主要功能是解開 rG4 結構，但這一簡單的 " 解旋酶 - 底物 " 模型難以解釋細胞如何在需要時維持 rG4 的功能性存在。 卵子發育過程中，大量合成和儲存 mRNA ，這些母源 mRNA 在卵母細胞成熟和早期胚胎發育中選擇性表達、儲存和降解， 為研究 rG4s 的功能提供了理想的模型。

近日，廣東省第二人民醫院 孫青原、歐湘紅、孟鐵剛、蘇瑞寶 團隊 在 Nucleic Acids Research 期刊上發表題為

Ultra-low-input rG4-seq reveals the RNA G-quadruplex regulome in gene expression and genome integrity

首先，研究團隊開發了超低輸入量 rG4 測序技術（ ULI-rG4-seq ），實現了從僅 100 個卵母細胞進行全轉錄組 rG4 圖譜繪制的技術突破。現有 rG4 檢測方法面臨嚴重的技術瓶頸： rG4-seq 雖能提供全轉錄組圖譜但需體外離子條件處理，可能無法反映生理狀態； DMS 化學探針雖可直接檢測細胞內狀態但易受其他結構元件干擾； G4RP-seq 使用結構特異性探針和化學交聯捕獲生理性 G4 ，但對低豐度轉錄本敏感性不足——所有這些方法均需要大量起始材料（數百萬細胞），限制了在珍貴臨床樣本或稀有細胞群體中的應用。

在卵子中， ULI-rG4-seq 捕獲的 rG4 顯著富集于關鍵調控區域，特別是轉錄起始位點（ TSS ）和轉錄終止位點（ TES ）附近。基因組分布分析顯示 rG4 在 5'UTR （ 6.69% ）和 3'UTR （ 18.88% ）區域相對于其基因組大小呈現非隨機分布，另外在外顯子（ 49.35% ）和內含子（ 14.74% ）中也檢測到豐富信號。這種策略性定位提示 rG4 可能作為結構開關，協調轉錄和轉錄后加工過程。 進一步的功能分析 揭示，含 rG4 的轉錄本顯著富集于細胞穩態的基本生物學過程，包括 mRNA 加工、染色質修飾、細胞周期控制、翻譯調控和 RNA 穩定性通路。

為闡明 rG4 調控的基本原理，研究團隊選擇了 DHX36 作為研究對象——這是一個保守的 rG4 解旋酶，在 RNA 結構調控中具有潛在作用。 研究團隊建立 純合 Dhx36 敲入小鼠模型（ Dhx36 ki/ki ），表達內源標簽 DHX36-GFP 融合蛋白。該模型顯示 DHX36 在整個發育過程中主要定位于細胞質，即使核輸出抑制劑 等 處理后仍維持胞質定位，提示這是進化保守的機制。

最關鍵的發現：通過結合 DHX36-GFP 敲入模型與 Trim-away 技術實現急性蛋白降解，研究者揭示了 一個意外 現象—— DHX36 急性缺失（ Trim-away 3 小時內降解）導致 rG4 顯著積累，而慢性缺失（ Dhx36 fl/ fl ;SKO 卵母細胞 ）引起 rG4 水平全局降低（ P < 0.0001 ）。這改變了對 DHX36 的 功能 認識： DHX36 不是簡單解旋酶，而是 rG4 穩態的 " 雙時相守護者 " ——既是即時解旋因子，又是長期水平維持者，揭示了細胞維持 RNA 結構平衡的精密反饋機制。

細胞質 DHX 36 如何指揮核內基因表達 呢？整合 DHX36 LACE-seq 和 ULI-rG4-seq 數據，鑒定出 3,405 個共享靶標（占 DHX36 結合轉錄本 79% ，含 rG4 轉錄本 62% ）。盡管 DHX36 主要定位于細胞質，其缺失卻嚴重影響核內基因表達。全局轉錄分析顯示 Dhx36 fl/fl ;SKO 卵母細胞轉錄活性顯著降低（ P < 0.0001 ），但 RNA 聚合酶 II （ Pol II ）水平卻升高，提示轉錄暫停。 Pol II CUT&Tag 分析證實， Dhx36 fl/fl ;SKO 卵母細胞在 TSS 處出現 Pol II 積累，在含 rG4 和 DHX36 結合的轉錄本中尤為明顯。用 rG4 穩定劑 cPDS 處理對照卵母細胞完全重現了這一表型，建立了 rG4 結構與轉錄暫停的因果關系。機制研究揭示， DHX36 通過解開轉錄延伸正向因子（ P-TEF ）組分 CCNT1 和 TCEA1 轉錄本中的 rG4 結構，確保其高效翻譯。盡管 Dhx36 fl/fl ;SKO 卵母細胞中總 Pol II 升高，延伸型 Pol II （ Ser2 磷酸化）及其激酶 CDK9 水平卻降低（ P < 0.0001 ），表明轉錄延伸受損。 顯微注射 RNaseH1 mRNA 或 α - 鵝膏蕈堿抑制轉錄均顯著降低 R-loop 和γ H2AX 信號，建立因果關系。這揭示了機制級聯： DHX36 依賴的 rG4 穩態維持→延伸因子適當表達→防止轉錄應激和 R-loop 形成→維護基因組完整性。

在生理水平上， DHX36 缺失的雌性小鼠卵子質量存在嚴重缺陷，大部分卵母細胞停滯在生發泡（ GV ）階段，無法完成減數分裂成熟，喪失發育潛能。組織學分析揭示 DHX36 敲除小鼠卵泡儲備加速耗竭，呈現典型卵巢早衰（ POF ）表型，完全不育。在哺乳動物體內建立了 RNA 結構穩態與女性生殖健康的直接因果關系。

綜上所述， 本研究通過 ULI-rG4-seq 技術 在理論上 揭示了 DHX36 精密調控的 RNA G- 四鏈體結構動態維持新機制 ， 建立了關鍵概念：（ 1 ） RNA 結構調控的雙時相特征；（ 2 ）跨區室調控機制；（ 3 ） RNA 結構作為多層次基因表達網絡的主控開關；（ 4 ） RNA 結構穩態作為基因組完整性的上游保障。 同時也揭示了 rG4 在卵子發育、卵子質量控制及雌性生殖力維持中發揮重要作用。 這些進步不僅深化了對 RNA 調控的理解，也為理解卵巢早衰等生殖疾病提供了新視角，并為開發靶向 RNA 結構動態的治療策略奠定了基礎。

論文鏈接：https://doi.org/10.1093/nar/gkag040

制版人：十一

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