動物模型構建與評估丨Shank3 基因功能缺失模型

采用新生大鼠側腦室注射Shank3干擾慢病毒的方法構建孤獨癥譜系障礙（ASD）相關 Shank3 基因功能缺失模型。Shank3 是與突觸結構和功能密切相關的高風險 ASD 候選基因，其表達下調可模擬孤獨癥核心行為特征，如社交缺陷、重復刻板行為及認知異常，為機制研究和干預探索提供可靠動物模型。

Shank3干擾慢病毒側腦室注射造模

選用8只SPF級SD孕鼠，自然分娩后共獲得新生仔鼠70只。于出生后第3天（P3），對仔鼠進行右側側腦室慢病毒立體定位注射，以構建Shank3基因干擾模型。

根據實驗設計，仔鼠隨機分為兩組：Shank3干擾組：注射1 μL含GFP熒光標記的Shank3特異性shRNA慢病毒；空載對照組：注射1 μL含GFP的空載體慢病毒。

病毒溶液通過玻璃毛細針經微量注射泵緩慢注入右側側腦室。注射完成后，將仔鼠置于熒光體視顯微鏡下，初步觀察側腦室區域GFP信號，確認注射位置準確。為驗證病毒轉染效率，于注射后第3天（P6），每組隨機選取1只仔鼠，斷頭取腦，制備20 μm厚冰凍冠狀切片。在熒光顯微鏡下（10×物鏡）觀察發現，Shank3干擾組側腦室周圍細胞均呈現清晰、廣泛的GFP熒光表達，表明慢病毒成功感染并有效表達。

仔鼠飼養至P21時進行單籠分養。從全部雄性仔鼠中隨機選取40只用于后續實驗；若出現不明原因脫毛（可能與應激或個體健康狀況相關）則剔除，只選取健康雄性幼鼠（Shank3干擾組與空載對照組各18只）進行行為學實驗。

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行為學實驗方法

為系統評估Shank3干擾對神經發育及行為功能的影響，本研究在仔鼠P35–P40日齡期間依次開展以下四項標準化行為學測試：

三箱社交實驗（Three-Chamber Social Test）：

用于檢測社交趨近能力與社交新穎性偏好。實驗裝置由三個等大相連的透明亞克力箱室組成（每室約20 cm × 40 cm × 22 cm），兩側箱室各放置一個帶孔圓柱籠（用于容納刺激動物或物體）。

社交能力階段（P35）：將受試大鼠置于中室，適應5 min后開始正式測試。一側籠內放入陌生同性別SD大鼠（Stranger 1），另一側放入等體積無生命物體（Object 1）。記錄10 min內受試鼠在左右箱室的停留時間及主動嗅探時間。

社交新穎性階段：緊接著第一階段，將原Object 1替換為另一只新的陌生大鼠（Stranger 2），其余條件不變。再次記錄10 min內受試鼠對熟悉鼠（Stranger 1）與新鼠（Stranger 2）的嗅探時間，評估其對社交新奇刺激的偏好。

曠場實驗（Open Field Test）：

用于評估焦慮樣行為及一般活動水平。實驗在100 cm × 100 cm × 40 cm的黑色不透明方形敞箱中進行（P37）。將受試大鼠輕柔置于箱體中央，自動視頻追蹤系統記錄其10 min內的運動軌跡。主要分析指標包括：

在中央區域（定義為距邊緣≥20 cm的正方形區域）與外周區域的停留時間；

總移動距離（反映自發活動能力）。

理毛行為實驗（Self-Grooming Test）：

用于量化重復刻板行為。實驗于P37在與曠場實驗相同的100 cm × 100 cm × 40 cm黑色敞箱中進行。將受試大鼠單獨放入箱內，允許其自由探索10 min，全程錄像。記錄大鼠自我理毛（包括舔前肢、擦拭面部、梳理軀干等連續動作）的總持續時間。

Morris水迷宮實驗（Morris Water Maze, MWM）：

用于評估空間學習與長期記憶能力，實驗于P38–P42進行。

定位航行訓練（P38–P42，共5天）：圓形水池直徑120 cm，水深30 cm，水溫維持在22 ± 1°C，平臺位于西南象限，水面下1 cm不可見。每天將大鼠從四個不同起始象限隨機入水一次，限時90 s。若未找到平臺，則引導其上臺并停留15 s。記錄每次找到平臺的潛伏期和游泳路徑總長度。

空間探索測試（P43）：移除平臺，將大鼠從原東北象限入水，自由游泳60 s。記錄其穿越原平臺所在位置（目標象限內直徑15 cm圓形區域）的次數、在目標象限停留時間占比及總游泳距離，以評估空間記憶保持能力。

所有行為實驗均在固定時間段（上午9:00–12:00）進行，實驗前動物適應測試房間至少30 min。設備在每只動物使用后徹底清潔，避免氣味干擾。數據分析采用專業行為學軟件。

參考文獻：

• MINAKOVA E, LANG J, MEDEL-MATUS J S, et al. Melanotan-II reverses autistic features in a maternal immune activation mouse model of autism [J]. PLoS One, 2019, 14(1): e0210389.

• 陳曉芳,王娟,歐萍,等.黑皮質素受體激動劑改善Shank3基因缺陷孤獨癥模型大鼠行為的機制研究[J/OL].中國比較醫學雜志,1-10[2026-01-01].

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