62個候選基因篩選，解鎖生物制藥高效生產新密碼

摘要：CHO細胞是生物制藥中重組蛋白生產的核心宿主，但宿主細胞蛋白（HCPs）作為工藝雜質，會增加下游純化成本、影響產品安全性。本研究通過蛋白質組學篩選出高豐度、難去除的HCPs，利用CRISPR多重基因敲除技術，在CHO細胞中實現了最多11個HCP相關基因的敲除，最終使分泌型HCPs水平降低57%~85%，且未損害細胞生長和產率，其中纖連蛋白1（FN1）敲除還能顯著提升培養性能，為生物制藥高效、清潔生產提供了全新的工程化CHO細胞底盤。

一、CHO細胞的“雜質痛點”，生物制藥的卡脖子難題

作為重組治療性蛋白生產的主力軍，CHO細胞憑借高產能、人源化翻譯后修飾等優勢，支撐了絕大多數獲批生物藥的生產。但生產過程中釋放的宿主細胞蛋白（HCPs），是最頭疼的工藝相關雜質。這些蛋白不僅會給細胞帶來代謝負擔，還會增加下游純化的難度和成本，微量殘留甚至可能影響藥物穩定性、引發患者免疫反應，成為生物制藥生產的一大痛點。傳統下游純化能去除大部分HCPs，卻對部分高豐度、難清除的HCPs束手無策，從上游改造細胞減少HCPs，成了行業的重要研究方向。

二、精準定位！找出該敲除的“問題HCPs”

要改造細胞，首先得找準目標。研究團隊對不同克隆、不同產品的CHO細胞培養上清，以及下游純化各步驟的樣品做了蛋白質組學分析，用LC–MS/MS鑒定出1254種HCPs，最終篩選出67種“核心HCPs”——它們僅占總種類的5%，卻貢獻了63%的總HCP質量，是代謝負擔的主要來源。

同時團隊發現，經Protein A捕獲、離子交換層析等標準純化步驟后，仍有PRDX1、CLU等HCPs持續殘留，這類難去除的蛋白也被納入敲除候選名單。結合能量成本分析和純化持久性，研究最終確定了71個HCP相關候選基因，為后續敲除篩選打下基礎。

三、層層篩選！62個基因里挑出36個“安全敲除靶點”

確定候選基因后，團隊用CRISPR/Cas9技術，通過混合敲除和單細胞敲除兩種方式，對62個可實驗的候選基因進行篩選（9個因技術問題未評估）。研究設置了嚴格的篩選標準：敲除后細胞需保持正常的生長活力和蛋白產率，且敲除效率穩定（傳代過程中敲除評分漂移不超過10%）。

實驗中發現，部分基因如GAPDH、EEF1A1是細胞必需的，敲除后細胞無法存活或增殖受阻；而另一部分基因敲除后，細胞性能未受影響甚至提升。最終從62個基因中，篩選出36個適合進行宿主細胞簡化的有效靶點，這些靶點敲除后不會對CHO細胞的核心生產性能造成負面影響。

四、意外驚喜！FN1敲除，既減雜質又提生產性能

在篩選過程中，纖連蛋白1（FN1）敲除成為最大的驚喜。團隊將FN1敲除引入4個不同的NISTmAb生產CHO克隆，發現敲除后細胞的培養穩定期顯著延長，活力下降速度明顯放緩，葡萄糖代謝和乳酸分泌卻未發生明顯變化。

這種表型直接帶來了生產效益的提升：FN1敲除株的積分活細胞濃度（IVCC）更高，培養時長延長，最終重組蛋白滴度平均提升30%以上。這一效果在不同克隆中均能重現，說明FN1敲除是提升CHO細胞生產性能的通用策略，也讓其成為后續多重敲除的核心靶點之一。

五、多重敲除！7基因編輯實現58% HCPs降低

基于篩選出的靶點，研究團隊率先開展了7重基因敲除，靶向BGN、FN1、LPL等7個高豐度/難去除的HCP相關基因，這些基因對應的蛋白約占總HCP質量的15%。通過CRISPR RNP復合物共轉染，獲得了敲除效率均超80%的細胞池，經單細胞克隆后，得到了4重至7重敲除的不同克隆株。

7重敲除株在補料分批培養中，展現出和FN1單敲除相似的延長穩定期表型，且在培養第7天，分泌型HCPs水平較野生型降低58%，遠高于預期的15%。這說明多重敲除不僅能直接去除靶向蛋白，還會通過干擾細胞外基質分泌等途徑，間接減少其他HCPs的釋放，產生“疊加效應”。

六、升級改造！11重敲除將HCPs降低至85%

在7重敲除的基礎上，研究團隊以高產能的6重敲除克隆為底盤，繼續敲除HSP90AA1、CLU等4個基因，實現了11重基因敲除，其中CLU還是典型的難去除HCPs。盡管因2個靶點敲除效率稍低，僅獲得4株純合11重敲除克隆，但這些克隆仍保持了良好的細胞活力。

培養第11天，11重敲除細胞池的HCPs水平較野生型降低85%，敲除克隆也實現了57%的降低，且部分克隆仍保持了較高的重組蛋白產率。這一結果證實，CHO細胞能耐受至少11個HCP相關基因的敲除，多重基因編輯的策略具有良好的可擴展性。

七、研究啟示，清潔CHO細胞的未來應用

這項研究的成果，為生物制藥生產帶來了多重價值。首先，上游基因編輯從源頭減少HCPs，能大幅降低下游純化的壓力，甚至可能簡化純化步驟，降低生產總成本；其次，FN1等基因的敲除，實現了“減雜質+提產率”的雙重效果，讓工程化CHO細胞的生產效率更高；另外，敲除株保留了CHO細胞的核心生產特性，能適配現有工業生產平臺，產業化轉化的難度較低。

當然研究也發現，培養后期的細胞裂解會釋放胞內蛋白，抵消部分敲除帶來的HCPs降低效果。后續可結合早收獲工藝或抗凋亡基因編輯，進一步減少后期HCPs的釋放。而此次篩選出的36個安全靶點，也為后續開發更優的清潔CHO底盤細胞，提供了豐富的基因編輯組合選擇。

八、總結

從蛋白質組學精準篩靶，到CRISPR多重基因編輯，這項研究成功打造了一款“清潔型”CHO細胞底盤，通過最多11個基因的敲除，實現了HCPs水平57%~85%的降低，且未犧牲細胞生長和產率，還意外發現FN1敲除能顯著提升生產性能。這一研究不僅為解決生物制藥的HCPs雜質難題提供了全新方案，也為CHO細胞的理性工程化改造提供了重要的靶點庫和技術思路，未來隨著技術的進一步優化，清潔CHO細胞有望成為生物制藥生產的新一代核心宿主，推動行業向更高效、更清潔、更安全的方向發展。

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